一种使用ES打靶技术获得的嵌合体鼠生殖遗传的挽救方法技术

本发明专利技术公开了一种使用ES打靶技术获得的嵌合体鼠生殖遗传的挽救方法，包括以下步骤：S1多轮电转的ES克隆注射囊胚，获得低嵌合率小鼠；所述ES克隆加上EGFP表达；S2对低嵌合率小鼠进行毛色比例分析和鼠尾基因鉴定；S3小鼠精子冷冻；S4精子基因型鉴定；S5阳性比例高的精子进行体外受精IVF实验；S6受精卵培养到2细胞后进行荧光观察；S7筛选绿色荧光胚胎移植；S8出生小鼠DNA鉴定；本发明专利技术解决了多步ES技术打靶的克隆所得到的首建鼠嵌合率低生殖遗传不确定的问题。确定的问题。确定的问题。

【技术实现步骤摘要】
一种使用ES打靶技术获得的嵌合体鼠生殖遗传的挽救方法


[0001]本申请涉及基因修饰模型鼠的生殖遗传比率分析方法及保种应用，属于生物
，特别涉及一种ES多次打靶获得的低嵌合率首建鼠生殖遗传的挽救方法。

技术介绍

[0002]现有的基因修饰技术：传统的转基因(TG)技术和近几年火热的CRISPR/Cas9 技术都是通过原核显微注射的方式将外源DNA注入核区，但TG方式获得的小鼠基因组是随机整合了外源DNA，表达水平也不一致；CRISPR/Cas9技术是通过Cas9 核酸酶通过sgRNA靶向切割DNA双链，诱导外源DNA与切口上下游的同源序列发生同源重组，该方法获得的小鼠基因组是定点修饰了外源DNA，但是sgRNA靶序列只有～20bp，Cas9核酸酶容易发生脱靶切割。ES(全能干细胞)打靶是建立在 DNA同源重组与胚胎干细胞等技术基础上的分子生物学技术，目前是模式动物制备的黄金标准。ES打靶技术成功避开了转基因的随机整合和CRISPR/Cas9无法避免的脱靶效应。
[0003]近几年，人源化动物模型已经被证明在解码人类疾病奥秘中具有巨本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种使用ES打靶技术获得的嵌合体鼠生殖遗传的挽救方法，其特征在于，包括以下步骤：S1多轮电转的ES克隆注射囊胚，获得低嵌合率小鼠；所述ES克隆加上EGFP表达；S2对低嵌合率小鼠进行毛色比例分析和鼠尾基因鉴定；S3小鼠精子冷冻；S4精子基因型鉴定；S5阳性比例高的精子进行体外受精IVF实验；S6受精卵培养到2细胞后进行荧光观察；S7筛选绿色荧光胚胎移植；S8出生小鼠DNA鉴定。2.根据权利要求1所述的一种使用ES打靶技术获得的嵌合体鼠生殖遗传的挽救方法，其特征在于，所述步骤S1中，所述所述ES克隆加上EGFP表达具体为在外源DNA序列上增加EGFP表达框，同时两端加上重组酶位点以便后期删除。3.根据权利要求2所述的一种使用ES打靶技术获得的嵌合体鼠生殖遗传的挽救方法，所述EGFP表达框序列为SEQ ID NO：1。4.根据权利要求2所述的一种使用ES打靶技术获得的嵌合体鼠生殖遗传的挽救方法，所述EGFP表达框两端设计有loXP序列，具体为SEQ ID NO：2。5.根据权利要求1所述的一种使用ES打靶技术获得的嵌合体鼠生殖遗传的挽救方法，其特征在于，所述步骤S3中小鼠精子冷冻包括如下步骤：a.挑选黑色毛发嵌合率高的12周龄F0小鼠，准备好冷冻保护试剂和器材；b.将雄鼠颈椎脱臼处死，剪下双侧附睾尾置于滤纸上，去除多余组织、血迹等；c.吸取500
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L CPA于四孔板；d.用系线镊挤压附睾尾呈饱满状态，剪开顶部取出精子团，放入冷冻液CPA中，摇晃混匀、置于CO2培养箱内10 min；e.分装60
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L/管规格存放冻存管中，放入液氮盒10min，留一管质检，剩余全部放入液氮罐保存。6.根据权利要求1所述的一种使用ES打靶技术获得的嵌合体鼠生殖遗传的挽救方法，其特征在于，所述步骤S4精子基因型鉴定具体步骤为：1)精子DNA提取：每个line取一管精子样品提取DNA，使用SDS配方的裂解液裂解精子样品，再用酚氯仿抽提去掉杂质，用乙醇沉淀DNA后，加75%乙醇清洗两遍，最后用超纯水溶解DNA；2）基因型鉴定：...

【专利技术属性】
技术研发人员：苏翠，姜伟，朱银峰，
申请(专利权)人：赛业苏州生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：