一种细胞贴附性能增强的微载体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种细胞贴附性能增强的微载体及其制备方法和应用，属于动物细胞培养技术领域。本发明专利技术首先将通用型微载体与磷酸缓冲液混合，加入到硅化过的容器并搅拌，插入两个铁电极，并分别与直流电源的正负极相连并接通电源，持续搅拌并通电使铁电极氧化并溶解，停止通电后继续搅拌若干时间，制得铁离子修饰的微载体，将上述铁离子修饰的微载体与磷酸缓冲液分离后，进行无菌化处理即可得到细胞贴附性能增强的微载体。本发明专利技术的微载体同时解决了悬浮培养过程中的细胞脱落问题以及细胞生长缓慢问题，使包括但不限于猪骨骼肌卫星细胞等的动物贴壁细胞大规模高密度培养成为可能。动物贴壁细胞大规模高密度培养成为可能。动物贴壁细胞大规模高密度培养成为可能。

【技术实现步骤摘要】
一种细胞贴附性能增强的微载体及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及一种细胞贴附性能增强的微载体及其制备方法和应用，属于动物细胞培养
，尤其是动物细胞高密度大规模培养领域，尤其适用于细胞培养肉生产中哺乳动物骨骼肌干细胞或骨骼肌细胞，如牛骨骼肌卫星细胞，猪骨骼肌卫星细胞的高密度大规模悬浮培养。

技术介绍

[0002]动物细胞微载体悬浮培养作为动物细胞大规模高密度培养的主要方法，解决了贴壁细胞无法直接悬浮培养的问题。微载体能够为贴壁的动物细胞提供更多可利用的表面，提高了细胞对单位体积培养基的利用率。悬浮培养一般通过内部搅拌或者曝气的方法实现。虽然动物细胞耗氧量小，无需太大的搅拌速率或太大的通气量就能满足细胞生长所需氧气，但当搅拌速率小或者通气量过小时，培养液混合不均匀会导致局部代谢废物积累影响细胞的生长，严重时会导致细胞凋亡，所以为了避免混合不均匀必须保持一定的搅拌速率或者通气量；在满足混合条件的情况下培养时，处于动态环境中的细胞和微载体会出现细胞从微载体上脱落进而生长缓慢甚至凋亡的现象。
[0003]为了解决这个问题，某些微载体可以通过表面覆盖变性胶原蛋白用于改善细胞贴壁性能。然而，由于胶原本身是动物性来源，成本较高，质量波动较大且容易污染。用于细胞培养肉生产时，胶原的使用还与细胞培养肉不含动物制品的初衷相违背。鉴于此，有必要开发一种简便且不含动物制品的微载体贴壁性能提升的方法。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于解决某些贴壁依赖型细胞，如猪骨骼肌卫星细胞、牛骨骼肌卫星细胞悬浮培养时在通用型微载体表面生长缓慢，以及贴壁不牢固导致的细胞脱落致死问题，本专利技术所制备的微载体允许细胞培养反应器操作在较高的搅拌转速和较大的通气量下，进而满足贴壁依赖型细胞高密度大规模悬浮培养时对快速混合和良好传质的要求。
[0005]本专利技术通过下述技术方案实现：
[0006]本专利技术首先提供了一种增强微载体细胞贴附性能的微载体的制备方法，所述方法包括以下步骤：
[0007](1)将通用型微载体与磷酸缓冲液混合，加入到硅化过的容器并搅拌；
[0008](2)在上述容器中插入两个铁电极，并分别与直流电源的正负极相连并接通电源；
[0009](3)持续通气并通电使铁电极氧化并溶解，通气、通电时间与微载体溶液的体积比值为0.5h/L
‑
5h/L，通电电流为20mA
‑
300mA；
[0010](4)停止通电后继续搅拌一段时间，制得铁离子修饰的微载体；
[0011](5)将步骤(4)得到的铁离子修饰的微载体与磷酸缓冲液分离后，进行无菌化处理即可得到细胞贴附性能增强的微载体。
[0012]在本专利技术的一种实施方式中，步骤(1)中，所述通用型微载体为任意适合贴壁依赖
型哺乳动物细胞的贴附与生长的微载体，无需专门适用某一种或某几种细胞的贴壁生长。
[0013]在本专利技术的一种实施方式中，步骤(1)中，所述通用型微载体包括基于交联葡聚糖基架的微载体、基于纳米高分子材料的微载体或基于蛋白质的微载体的任一种或几种。
[0014]在本专利技术的一种实施方式中，步骤(1)中，优选的，所述通用型微载体的表面未覆盖变性胶原蛋白。
[0015]在本专利技术的一种实施方式中，步骤(1)中，所述通用型微载体粒径分布在100～200μm之间。
[0016]在本专利技术的一种实施方式中，步骤(1)中，所述磷酸缓冲液的pH为7.2
‑
7.6，更优的pH为7.4，且不含Ca
2+
，Mg
2+
。
[0017]在本专利技术的一种实施方式中，步骤(1)中，所述磷酸缓冲液由磷酸二氢钾，十二水合磷酸氢二钠，氯化钠配置；优选地，磷酸二氢钾：十二水合磷酸氢二钠：氯化钠的摩尔比为1:184:26。
[0018]在本专利技术的一种实施方式中，步骤(1)中，所述通用型微载体的质量与磷酸缓冲液的体积比小于1:20g/mL；优选的，所述微载体的质量与磷酸缓冲液的体积比小于1:25g/mL。
[0019]在本专利技术的一种实施方式中，步骤(1)中，所述硅化过的容器通过以下方法制备：先将容器洗净，烘干之后用硅化剂润洗容器后再烘干，最后用水冲洗即可，其中，所述硅化剂由正庚烷与二氯二甲基硅烷配制而成，所述正庚烷与二氯二甲基硅烷体积比为18
‑
20，优选为19:1。
[0020]在本专利技术的一种实施方式中，步骤(1)中，搅拌的目的是使微载体悬浮，可以通过磁力搅拌实现，也可以通过通入空气实现；较优的，通入空气除可以实现微载体悬浮，所提供的氧气还可促进电极氧化，所述空气优选为无菌压缩空气。
[0021]在本专利技术的一种实施方式中，步骤(1)中，所述容器优选为鼓泡塔反应器，可以直接通气进行混合。
[0022]在本专利技术的一种实施方式中，步骤(2)中，所述铁电极的材质为铁或含铁的合金，优选为纯铁材质。所述铁电极的面积和电极间的距离适当，以产生20mA
–
300mA范围内的电流。
[0023]在本专利技术的一种实施方式中，步骤(2)中，直流电源的电压范围为0
‑
36V；较优的，电压范围为3.3
‑
24V；更优的，电压为5V。在本专利技术的一种实施方式中，步骤(3)中，通气的气体流量要求大于微载体悬浮的气速但不能使液体溢出容器。
[0024]在本专利技术的一种实施方式中，步骤(3)中，微载体溶液的通气悬浮时间与溶液中微载体含量有关，微载体含量越高，通气/通电时间越长；优选地，微载体含量为10％时，通气或通电时间与微载体溶液的体积比值为0.5h/L。
[0025]在本专利技术的一种实施方式中，步骤(4)中，所述一段时间优选为5
‑
10min。
[0026]在本专利技术的一种实施方式中，步骤(5)中，制得的微载体与磷酸缓冲液分离后，需使用不含Ca
2+
，Mg
2+
的磷酸缓冲液冲洗，然后湿热灭菌或酒精灭菌；较优的，选择湿热灭菌或者酒精浸泡灭菌；更优地，湿热灭菌温度为121℃高压灭菌15min，酒精灭菌选用70％的酒精浸泡。
[0027]本专利技术还提供了上述制备方法制备得到的细胞贴附性能增强的微载体。
[0028]本专利技术还提供了一种细胞悬浮培养的方法，所述方法采用上述细胞贴附性能增强
的微载体进行悬浮培养。
[0029]在本专利技术的一种实施方式中，所述细胞为贴壁细胞，具体为哺乳动物贴壁细胞。
[0030]在本专利技术的一种实施方式中，所述细胞包括猪骨骼肌卫星细胞、牛骨骼肌卫星细胞、HEK293T细胞等的一种。
[0031]最后，本专利技术还提供了上述细胞贴附性能增强的微载体在细胞培养领域的应用。
[0032]有益效果：
[0033]在铁离子修饰的微载体上生长培养细胞与在市售通用型微载体上生长相比，同时解决了悬浮培养过程中的细胞脱落问题以及细胞生长本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种细胞贴附性能增强的微载体的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)将通用型微载体与磷酸缓冲液混合，加入到硅化过的容器并搅拌；(2)在上述容器中插入两个铁电极，并分别与直流电源的正负极相连并接通电源；(3)持续通气并通电使铁电极氧化并溶解，通气、通电时间与微载体悬浮液的体积比值为0.5h/L
‑
5h/L，通电电流为20mA
‑
300mA；(4)停止通电后继续搅拌一段时间，制得铁离子修饰的微载体；(5)将步骤(4)得到的铁离子修饰的微载体与磷酸缓冲液分离后，进行无菌化处理即可得到细胞贴附性能增强的微载体。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述通用型微载体为任意适合于贴壁依赖型哺乳动物细胞的贴附与生长的微载体。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述通用型微载体包括基于交联葡聚糖基架的微载体、基于纳米高分子材料的微载体或基于蛋白质的微载体的任一种或几种。4...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐胜楠，刘宏斐，赵北辰，李雪良，陈坚，李江华，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：