一种同时检测小麦茎秆中九种木质素单体交联结构的方法技术

本发明专利技术公开了一种同时检测小麦茎秆中九种木质素单体交联结构的方法，所述木质素单体交联结构为S(8

【技术实现步骤摘要】
一种同时检测小麦茎秆中九种木质素单体交联结构的方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种同时检测小麦茎秆中九种木质素单体交联结构的检测方法。

技术介绍

[0002]近年来，随着化石燃料的温室气体排放，人们对植物秸秆作为乙醇来源的重视度越来越高。以木质纤维素生物质为原料生产的乙醇被称为第二代乙醇。第二代乙醇生产的主要障碍之一是难以分解的木质纤维素材料。例如，小麦秸秆主要由纤维素、半纤维素和木质素组成，要想分离它们，首先，必须对这种材料进行预处理以提取除去木质素，然后，纤维素被水解以释放葡萄糖，而葡萄糖随后被发酵并转化为乙醇，因此确定秸秆中木质素单体交联结构的组成和含量尤为重要。
[0003]木质素是一种复杂的酚类生物聚合物，很难被分解。木质素的生物合成主要基于由苯丙醇衍生的三种羟基苯丙烷类单体的自由基偶联(对羟基苯基木质素(H)，愈创木基木质素(G)和丁香基木质素(S))，通过一系列胞外酶(过氧化物酶和漆酶)介导的氧化反应。
[0004]木质素单体交联结构中8
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4连接是最常见的，也比其他化学连接更容易断裂。木质素单体的相对比例决定了单元间连接的相对丰度。例如，富含G单元的木质素含有较多的难以分解8
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5、5
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5和5
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4键，而富含S单元的木质素交联度较低，提取的难度较小。因此，木质素的组成通常用H、G和S单位的相对丰度和比率来描述。由于小麦茎秆制备乙醇的可提取性和可消化性不仅受木质素量的影响，而且还受其单体组成和单体在植物细胞壁中的排列方式的影响，因此当研究如何用小麦茎秆制备乙醇时，确定这些信息就显得尤为重要。
[0005]木质素含量通常通过常规重量法测量，最常见的是酸分解法(基于细胞壁材料的分离)以及分光光度法，如溴乙酰法和巯基乙酸法，它们降解细胞壁和木质素并测定可溶性降解产物。然而，测定同一样品中木质素的方法导致对木质素浓度的不同估计。这些方法还包含在细胞壁中的不溶性木质素的含量，还可能包括了木质素多聚体的结构，结果很不准确。

技术实现思路

[0006]基于现有技术中的问题，本专利技术建立了一种简单的方法，使用不同比例的三种单体和过氧化物酶来模拟自然聚合过程，在体外聚合木质素。所得化合物可通过超高效液相色谱(UPLC)与串联质谱(MS/MS)联用进行分析。然后，将植物组织中发现的可溶性木质素温和提取而不降解，利用超高效液相色谱(UPLC)与串联质谱(MS/MS)联用测定其结构和含量。本专利技术对小麦茎秆可溶性木质素低聚体进行了分析，更精确的测定小麦茎秆木质素单体交联结构组成和含量，为小麦秸秆制备乙醇提供科学依据。
[0007]本专利技术的目的之一在于提供一种同时检测小麦茎秆中九种木质素单体交联结构的方法，所述木质素单体交联结构为S(8
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4)S(8
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8)S、S(8
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4)G(8
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4)S、G(8
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4)S(8
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5)G、S(8
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4)S(8
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5)G、G(8
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5)G、S(8
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4)G、G(8
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8)G、G(8
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5)
H，采用UPLC
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MS/MS，色谱条件为：流动相A：超纯水，流动相B：乙腈，梯度洗脱(优选的：0
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0.5min，95％A，0.5
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3min，95％A
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75％A线性降低，3
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3.5min，75％A
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10％A线性降低，3
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4.0min，10％A，4.0
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4.1min，10％A
‑
95％A线性提高，4.1
‑
6.0min，95％A)。
[0008]优选的：所述色谱柱为C18，1.7μm，2.1
×
100mm，柱温为40℃。
[0009]优选的：所述质谱条件为：MS系统：ACQUITY XEVO TQ
‑
D，电离模式：电喷雾离子源负离子模式(ESI
‑
)；源温度：150℃，脱溶剂气温度：450℃；脱溶剂气流速：800L/h，锥孔气流速：30L/h，碰撞气流速：0.20mL/min，毛细管电压：负离子为2.5KV；脱溶剂气温度：450℃；扫描模式：多反应监测MRM；雾化气：氮气。
[0010]一种同时检测小麦茎秆中九种木质素单体交联结构的方法，具体步骤如下：
[0011](1)标准品的制备：将3种单体(对
‑
香豆醇(H)，松柏醇(G)，芥子醇(S))混合(每种单体3mg)溶于2mL含27mmol L
‑1的(CTA)2SO
4 pH 6.5的磷酸钠缓冲液(10mmol mL
‑1)中。然后加入67μL 3％H2O2和0.3mg II型辣根过氧化物酶。30℃下水浴1h，然后用1mL 5％的Na2S2O7水溶液中断反应。用0.6ml乙酸乙酯萃取木质素单体和低聚物，再用饱和NaCl水溶液洗涤、涡旋振荡2min，5000g离心5min，吸取上层清液，在真空浓缩仪中蒸干。最后，将干燥的样品溶解在2ml含有35％乙腈的水溶液中，等待上机。
[0012](2)样品处理：将液氮条件下磨碎的小麦茎秆冷冻干燥，加入萃取剂后混匀，所述萃取剂为乙醇：纯水＝80:20(体积比)；优选的：所述萃取剂与小麦茎秆的比例为4:1，mL：g。
[0013](3)超声水浴萃取(优选：1h)，离心(优选：5000g，离心5min)收集上清液并真空浓缩干燥；
[0014](4)将步骤(3)中的干燥样品溶解于超纯水中；
[0015](5)将步骤(4)处理后的混合物用乙酸乙酯萃取，离心(优选：5000g，离心5min)收集上清液；
[0016](6)将步骤(5)得到的上清液真空浓缩干燥后加入乙腈水(优选：乙腈：水＝35：65)溶解，过滤后采用超高效液相色谱串联质谱对S(8
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4)S(8
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8)S、S(8
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4)G(8
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4)S、G(8
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4)S(8
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5)G、S(8
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4)S(8
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5)G、G本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种同时检测小麦茎秆中木质素单体交联结构的方法，其特征是：所述木质素单体交联结构为S(8
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4)S(8
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8)S、S(8
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4)G(8
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4)S、G(8
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4)S(8
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5)G、S(8
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4)S(8
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5)G、G(8
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4)S(8
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8)S、G(8
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4)G(8
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5)G、S(8
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4)G、G(8
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8)G、G(8
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5)H，采用UPLC
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MS/MS，色谱条件为：流动相A：纯水，流动相B：乙腈，梯度洗脱。2.如权利要求1所述的方法，其特征是：所述梯度洗脱为：0
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0.5min，95％A，0.5
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3min，95％A
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75％A线性降低，3
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3.5min，75％A
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10％A线性降低，3
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4.0min，10％A，4.0
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4.1min，10％A
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95％A线性提高，4.1
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6.0min，95％A。3.如权利要求1所述的方法，其特征是：所述色谱柱为C18，1.7μm，2.1
×
100mm，柱温为40℃。4.如权利要求1所述的方法，其特征是：所述质谱条件为：MS系统：ACQUITY XEVO TQ
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D，电离模式：电喷雾离子源负离子模式；源温度：150℃，脱溶剂气温度：450℃；脱溶剂气流速：1000L/h，锥孔气流速：150L/h，碰撞气流速：0.15mL/min，毛细管电压：2.5KV；脱溶剂气温度：450℃；扫描模式：多反应监测MRM；雾化气：氮气。5.如权利要求1
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4任一所述的方法，其特征是：具体步骤如下：(1)标准品的制备：将对
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香豆醇(H)，松柏醇(G)，芥子醇(S))3种单体混匀溶于2mL含27mmol L
‑1的(CTA)2SO
4 pH 6.5的磷酸钠缓冲液，然后加入3％H2O2和0.3mg II型辣根过氧化物酶，30℃下水浴1h，然后用1mL 5％的Na2S2O7水溶液中断反应，用0.6ml乙酸乙酯萃取木质素单体和...

【专利技术属性】
技术研发人员：李勇，李春辉，金敏，骆永丽，汲丽莎，孙淑芳，王振林，
申请(专利权)人：山东农业大学，
类型：发明
国别省市：