一种蚕丝素固定化有机磷降解酶的制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种蚕丝素固定化有机磷降解酶的制备方法和应用，属于有机磷降解酶技术领域；蚕丝素固定化有机磷降解酶包括以下步骤：S1、选择原料：S2、制备再生蚕丝蛋白溶液；S3、制备蚕丝素固定化有机磷降解酶。本发明专利技术以无交联剂固定化包埋技术为手段，向再生蚕丝蛋白（RSF）溶液中加入有机磷降解酶（OPH），室温下混合，反应液经冷冻干燥制成OPH/RSF固定化酶；本发明专利技术的制备方法操作简单，反应条件温和、反应性强、热安全性好，无需使用交联剂，后处理简单，降低了生产成本，提高了酶载量，增加了酶活回收率，能够用于有机磷化合物的降解，同时采用天然蛋白材料，降低了固定载体材料对环境的二次污染。二次污染。二次污染。

【技术实现步骤摘要】
一种蚕丝素固定化有机磷降解酶的制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及降解酶
，具体是一种蚕丝素固定化有机磷降解酶的制备方法和应用。

技术介绍

[0002]有机磷降解酶又称磷酸三酯酶，可降解有机磷分子，破坏有机磷化合物分子和一些军用神经毒剂如沙林的磷酯键而使其脱毒。有机磷降解酶广泛存在于微生物、乌贼、原生生物、新鲜蚌类和许多哺乳动物体内。1946年，Mazur等人首次报道发现，此类酶存在于动物组织中，可以降解乙酰胆碱酶抑制剂二异丙基磷酰氯。有机磷降解酶种类繁多，分为水解酶、脱脂酶等，其中有机磷水解酶（OPH）是研究得最广泛的一类降解酶。OPH是一种有机磷化合物作为底物的酶，可以高效水解有机磷化合物中的P
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O、P
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S、P
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F和P
‑
CN键，且水解后的产物是无毒的。然而，OPH的活性受环境影响较大，特别是在高温、有机溶剂、去污剂等条件下其活性显著降低乃至失活，这在很大程度使其应用受到了一定的限制。
[0003]蚕丝素蛋白具有超微、多级结构，无毒、无刺激性、良好的生活相容性和可降解性等优点，在生物
，被用作酶固定化载体及生物传感器等的载体材料，用于医学治疗、生化和化学分析等领域。丝素在蚕体内以浓缩的液体形状式存在，以吐丝牵引成纤维状，足有高度定向结晶结构，当受到加热、冻结、酸解和有机溶剂就等处理后会发生结构和性质的变化，即水溶性的丝素蛋白可通过物理或化学过程变成非水溶性的，为酶在丝素蛋白中的固定提供了可能。蚕丝素作为酶的固定材料的显著特点在于：它不需任何交联剂，只需通过物理作用、化学处理，如：改变温度、溶液pH、溶剂等就可完成。因此在固定化过程中很少涉及化学试剂，大大地减少了酶的失活，增加了酶的利用效率；蚕丝素对大多数的常用溶剂都相当稳定，具有一定的机械强度和弹性；作为固定酶的载体，无化学反应，是比较温和的固定作用，固定能力强，热安全性好，对酶的处理和电的渗析作用等的抵抗性也高于溶液酶等；丝素蛋白变性的程度可以控制，提高了固定化酶的效率；丝素含有的氨基酸对人体无毒，安全性高；蚕丝经过适当的处理后，可以制成多种形状，因此，作为固定化载体材料，可以增加固定化酶的适用范围。
[0004]大量的研究证明蚕丝素蛋白是一种优良的固定化酶载体，具有反应条件温和、反应性强、热安全性好等优点。国外研究人员已经将葡糖氧化酶、脂肪酶和辣根过氧化物酶固定化到蚕丝蛋白，制备的固定化酶具较强的贮存稳定性和抵抗不良条件的能力。以蚕丝素蛋白为载体，采用包埋法固定化酶，还能够很好地避免以往固定化酶方法出现的问题，例如该固定化方法无需使用交联剂、无交联产物纯化等复杂步骤且固定化反应酶活回收率较高。
[0005]基于此，目前尚未见以蚕丝素为载体固定化有机磷降解酶的相关报道。且现有的主要通过将有机磷降解酶固定化到尼龙、聚氨酯、碳纳米管和硅等介质材料上的方法来提高其稳定性和使用效率。应用这些方法虽然提高了OPH抵御不利环境条件影响的能力，但大部分固定化过程相对复杂，需要使用交联剂，不仅增加了成本，而且固定化过程中酶活回收
率不高；此外，制备的固定化酶还存在OPH酶载量相对较低，长期室温贮存稳定性较差等缺点。通过上述方法将OPH固定化到介质材料上的能力十分有限，且很难将其应用在具OPH活性的功能性防护材料生产上。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种蚕丝素固定化有机磷降解酶的制备方法和应用，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。
[0007]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种蚕丝素固定化有机磷降解酶的制备方法，包括以下步骤：S1、选择原料：以天然蚕丝为原料；S2、制备再生蚕丝蛋白溶液；S3、制备蚕丝素固定化有机磷降解酶：以无交联剂固定化包埋技术为手段，向再生蚕丝蛋白溶液中加入有机磷降解酶，混合搅拌，反应液经冷冻干燥制成蚕丝素固定化有机磷降解酶。
[0008]作为本专利技术进一步的方案：所述S2中制备再生蚕丝蛋白溶液包括以下步骤：：（1）脱胶：称取一定量的蚕丝素样品置于碳酸钠溶液中煮沸，重复3次以上，用去离子水清洗，烘干，得脱胶蚕丝；（2）盐溶：将脱胶蚕丝溶于氯化钙乙醇溶液中；（3）透析：用透析袋对蚕丝蛋白溶液进行透析，去除水分，制备蚕丝蛋白粉末；（4）配制10%的再生蚕丝蛋白溶液：将蚕丝蛋白粉末溶于溶剂中得到10%的再生蚕丝蛋白溶液。
[0009]作为本专利技术进一步的方案：所述（1）中碳酸钠的质量分数为5%，煮沸时间为30min；去离子水温度为50
‑
65℃；所述（2）中氯化钙乙醇溶液为氯化钙、乙醇和水以摩尔比1:8:2混合得到。
[0010]作为本专利技术进一步的方案：所述（4）中溶剂为1倍的OPH缓冲溶液，包括：10毫摩尔每升的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，0.1%的吐温20，0.03毫摩尔每升的乙二胺四乙酸二钠，0.5毫摩尔每升的硫酸锌。
[0011]作为本专利技术进一步的方案：所述（4）中溶剂为2.5倍的OPH缓冲溶液，包括：25毫摩尔每升的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，0.25%的吐温20，0.075毫摩尔每升的乙二胺四乙酸二钠，1.25毫摩尔每升的硫酸锌。
[0012]作为本专利技术进一步的方案：所述（4）中溶剂为5倍的OPH缓冲溶液，包括：50毫摩尔每升的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，0.5%的吐温20，0.15毫摩尔每升的乙二胺四乙酸二钠，2.5毫摩尔每升的硫酸锌。
[0013]作为本专利技术进一步的方案：所述S3中有机磷降解酶的基因序列来自于假产碱单胞菌或黄杆菌。
[0014]作为本专利技术进一步的方案：所述S3中混合搅拌为摇床或机械混合搅拌。
[0015]作为本专利技术进一步的方案：所述S3中冷冻干燥为冻干机冷冻干燥。
[0016]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：以无交联剂固定化包埋技术为手段，向再生蚕丝蛋白（RSF）溶液中加入有机磷降解酶（OPH），室温下混合，反应液经冷冻干燥制成
OPH/RSF固定化酶；本专利技术的制备方法操作简单，反应条件温和、反应性强、热安全性好，无需使用交联剂，后处理简单，降低了生产成本，提高了酶载量，增加了酶活回收率，能够用于有机磷化合物的降解，同时采用天然蛋白材料，降低了固定载体材料对环境的二次污染。
附图说明
[0017]图1为蚕丝素固定化有机磷降解酶的工艺图；图2为甲基对硫磷的气相色谱图；图3为固定化酶降解甲基对硫磷的气相色谱图。
具体实施方式
[0018]下面结合具体实施方式对本专利的技术方案作进一步详细地说明。
[0019]实施例1一种蚕丝素固定化有机磷降解酶的制备方法，包括以下步骤：S1、选择原料：以天然蚕丝为原料；S2、制备再生蚕丝蛋白（RSF）溶液，包括以下步骤：（1）脱胶：称取一定量的蚕丝素样品置于质量分数为5%的碳酸钠溶液中煮沸30min，重复3次以上，用50℃去离子水清洗，烘干，得脱胶蚕丝；（2）盐溶：将脱胶蚕丝溶于氯化钙、乙醇和水以摩尔比1:8:2混合得到的氯化钙乙醇溶液中；（本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种蚕丝素固定化有机磷降解酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、选择原料：以天然蚕丝为原料；S2、制备再生蚕丝蛋白溶液；S3、制备蚕丝素固定化有机磷降解酶：以无交联剂固定化包埋技术为手段，向再生蚕丝蛋白溶液中加入有机磷降解酶，混合搅拌，反应液经冷冻干燥制成蚕丝素固定化有机磷降解酶。2.根据权利要求1所述的蚕丝素固定化有机磷降解酶的制备方法，其特征在于，所述S2中制备再生蚕丝蛋白溶液包括以下步骤：（1）脱胶：称取一定量的蚕丝素样品置于碳酸钠溶液中煮沸，重复3次以上，用去离子水清洗，烘干，得脱胶蚕丝；（2）盐溶：将脱胶蚕丝溶于氯化钙乙醇溶液中；（3）透析：用透析袋对蚕丝蛋白溶液进行透析，去除水分，制备蚕丝蛋白粉末；（4）配制10%的再生蚕丝蛋白溶液：将蚕丝蛋白粉末溶于溶剂中得到10%的再生蚕丝蛋白溶液。3.根据权利要求2所述的蚕丝素固定化有机磷降解酶的制备方法，其特征在于，所述（1）中碳酸钠的质量分数为5%，煮沸时间为30min；去离子水温度为50
‑
65℃；所述（2）中氯化钙乙醇溶液为氯化钙、乙醇和水以摩尔比1:8:2混合得到...

【专利技术属性】
技术研发人员：王洪波，徐冬，于艳杰，王金玉，刘昌财，
申请(专利权)人：中国人民解放军六一六九九部队，
类型：发明
国别省市：