【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分析化学领域及生物传感和分析检测技术方向，具体涉及一种基于噬菌体展示技术和纳米材料的电化学发光生物传感方法。
技术介绍
1、生物传感器是物理传感器、化学传感器外又一重要传感检测领域，通过将识别元件或者说敏感探针与目标物特异性作用产生的物理量、化学量变化转化为电信号，实现对目标物的定性、定量检测。生物传感器通常具有灵敏度高、选择性好、可控性强等特点，在医疗检测、环境监测、疫情防控中发挥着不可或缺的作用，也是科研领域中的重要发展方向。
2、电化学发光(electrochemiluminescence,ecl)传感器是生物传感器的重要类别之一。所谓电化学发光，指的是外接电压触发反应物发生氧化还原反应并形成激发态发光体而导致的发光现象，又称电致化学发光(electrogenerated chemiluminescence)。电化学发光检测技术将电化学与化学发光相结合，具有可控性好、灵敏度高、背景干扰小、检测效率高等显著优势，近年来在环境分析、医疗诊断、食品卫生检测等领域发展迅速。对于生物传感器而言，实现超高灵敏度检测始终是重要的发展方向，而电化学发光生物传感器也发展出多种信号放大方法以提高检测灵敏度，包括使用高效共反应物、纳米材料、酶催化技术、噬菌体展示技术等等。其中，噬菌体展示技术因具有突出优势而得到重视。
3、噬菌体展示技术是一种将外源蛋白或多肽基因导入噬菌体dna链，并与噬菌体特定蛋白基因融合表达于其衣壳表面的成熟技术，由smith等人于1985年首次建立并于2018年获得了诺贝尔奖。以噬菌体
4、尽管有较多优势，目前噬菌体展示技术在电化学发光生物传感器中的应用仍比较有限，且其利用方式主要是使用电化学发光信号分子直接标记噬菌体表位，如刘冰和穆晞惠等均以ru(bpy)32+(三联吡啶钌，重要的电化学发光标记材料)标记m13噬菌体展示抗体作为信号探针构建相思子毒素检测体系，对目标物的检出限大大降低，灵敏度比以抗体为探针显著提高。
5、但是噬菌体表位仍然没有得到充分利用，如果能够以纳米材料高密度富集信号分子并将其负载于噬菌体衣壳蛋白表面，电化学发光传感信号将能够得到显著增强。
6、因此，有必要进一步提高生物传感器的灵敏度，构建一种基于噬菌体展示技术和纳米材料的电化学发光生物传感方法，使得其具有极强的增敏效果。
技术实现思路
1、针对现有技术的不足，基于大幅提高生物传感器灵敏度的目的，本专利技术公开了一种基于噬菌体展示技术和纳米材料的电化学发光生物传感方法。该方法以噬菌体展示抗体/亲和体同时作为特异性敏感探针和信号材料载体，以纳米材料高密度吸附或偶联信号分子作为复合信号材料，并负载于噬菌体表面。由于噬菌体和纳米材料的双重信号放大效果，该传感方法对于蛋白类目标物的检测显示出极高的灵敏度。
2、为实现上述技术目的，本专利技术的技术方案如下：
3、一种基于噬菌体展示技术和纳米材料的电化学发光生物传感方法，包括如下步骤：
4、s1：制备磁性捕获探针、生物素标记噬菌体展示探针、标记纳米材料以及系列浓度的待测物溶液；
5、所述磁性捕获探针是捕获探针偶联并覆盖磁性微球表面形成的磁性复合体；所述捕获探针能够与待测物特异性结合；
6、所述生物素标记噬菌体展示探针为经生物素标记的能够表达与待测物特异性结合蛋白的噬菌体；
7、所述标记纳米材料为链霉亲和素、电化学发光材料同时标记的复合纳米材料；
8、s2：将磁性捕获探针与待测物溶液混合后共同孵育，将待测物溶液中的待测物捕获到磁性微球表面，得到“磁性捕获探针-待测物”溶液；
9、s3：将“磁性捕获探针-待测物”溶液进行磁分离，并以缓冲液充分清洗，然后加入生物素标记噬菌体展示探针并孵育，直至生物素标记噬菌体展示探针与磁性微球表面的待测物结合，形成“捕获探针-待测物-噬菌体展示探针”夹心结构，得到“捕获探针-待测物-噬菌体展示探针”溶液；
10、s4：将“捕获探针-待测物-噬菌体展示探针”溶液进行磁分离，并以缓冲液充分清洗，然后加入标记纳米材料并孵育，直至标记纳米材料充分结合于噬菌体表面，形成“捕获探针-待测物-噬菌体展示体-标记纳米材料”的复合夹心结构，得到“捕获探针-待测物-噬菌体展示体-标记纳米材料”溶液；
11、s5：将“捕获探针-待测物-噬菌体展示体-标记纳米材料”溶液进行磁分离，并以缓冲液充分清洗，然后加入电化学发光共反应液，混合均匀，得到混合液；
12、取混合液滴加到电极表面，以电化学发光传感器为平台检测发光信号，记录数据；
13、s6：测量所述系列浓度待测物溶液中不同浓度的待测物溶液的数据并分析数据，建立待测物浓度、发光信号之间数量关系，用于后续未知浓度待测物测算。
14、优选地，所述捕获探针为待测物的抗体、适配体或分子印迹聚合物；
15、所述磁性微球为采用链霉亲和素修饰的磁性微球或采用蛋白a修饰的磁性微球。
16、进一步地，当采用链霉亲和素修饰的磁性微球时，将捕获探针生物素化，然后与磁微球共同反应、结合。
17、进一步地，当采用蛋白a修饰磁微球时，将捕获探针直接与磁微球共同反应、结合。
18、优选地，所述标记纳米材料的纳米材料为有机纳米材料、无机纳米材料或复合纳米材料。
19、优选地，所述标记纳米材料的电化学发光材料包括三联吡啶钌、鲁米诺、量子点。
20、优选地，所述生物素标记噬菌体展示探针还经电化学发光材料修饰标记。
21、优选地，所述步骤s2～s4的孵育过程在pbs缓冲液中以垂直旋转方式进行，所述pbs缓冲液浓度为0.01mol/l，ph＝7.4。
22、优选地，所述步骤s3～s5中的缓冲液清洗以ph＝7.4、0.01mol/l的pbst进行。
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1.一种基于噬菌体展示技术和纳米材料的电化学发光生物传感方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种基于噬菌体展示技术和纳米材料的电化学发光生物传感方法，其特征在于，所述捕获探针为待测物的抗体、适配体或分子印迹聚合物；所述磁性微球为采用链霉亲和素修饰的磁性微球或采用蛋白A修饰的磁性微球。
3.根据权利要求2所述的一种基于噬菌体展示技术和纳米材料的电化学发光生物传感方法，其特征在于，当采用链霉亲和素修饰的磁性微球时，将捕获探针生物素化，然后与磁微球共同反应、结合。
4.根据权利要求2所述的一种基于噬菌体展示技术和纳米材料的电化学发光生物传感方法，其特征在于，当采用蛋白A修饰磁微球时，将抗体类捕获探针直接与磁微球共同反应、结合。
5.根据权利要求1所述的一种基于噬菌体展示技术和纳米材料的电化学发光生物传感方法，其特征在于，所述标记纳米材料的纳米材料为有机纳米材料、无机纳米材料或复合纳米材料。
6.根据权利要求3所述的一种基于噬菌体展示技术和纳米材料的电化学发光生物传感方法，其特征在于，所述标记纳米材料的电化
7.根据权利要求1所述的一种基于噬菌体展示技术和纳米材料的电化学发光生物传感方法，其特征在于，所述生物素标记噬菌体展示探针还经电化学发光材料修饰标记。
8.根据权利要求1所述的一种基于噬菌体展示技术和纳米材料的电化学发光生物传感方法，其特征在于，所述步骤S2～S4的孵育过程在PBS缓冲液中以垂直旋转方式进行，所述PBS缓冲液浓度为0.01mol/L，pH＝7.4。
9.根据权利要求1所述的一种基于噬菌体展示技术和纳米材料的电化学发光生物传感方法，其特征在于，所述步骤S3～S5中的缓冲液清洗以pH＝7.4、0.01mol/L的PBST进行。
10.根据权利要求1所述的一种基于噬菌体展示技术和纳米材料的电化学发光生物传感方法，其特征在于，所述步骤S6中通过外标法建立待测物浓度、发光信号之间数量关系。
...【技术特征摘要】
1.一种基于噬菌体展示技术和纳米材料的电化学发光生物传感方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种基于噬菌体展示技术和纳米材料的电化学发光生物传感方法，其特征在于，所述捕获探针为待测物的抗体、适配体或分子印迹聚合物；所述磁性微球为采用链霉亲和素修饰的磁性微球或采用蛋白a修饰的磁性微球。
3.根据权利要求2所述的一种基于噬菌体展示技术和纳米材料的电化学发光生物传感方法，其特征在于，当采用链霉亲和素修饰的磁性微球时，将捕获探针生物素化，然后与磁微球共同反应、结合。
4.根据权利要求2所述的一种基于噬菌体展示技术和纳米材料的电化学发光生物传感方法，其特征在于，当采用蛋白a修饰磁微球时，将抗体类捕获探针直接与磁微球共同反应、结合。
5.根据权利要求1所述的一种基于噬菌体展示技术和纳米材料的电化学发光生物传感方法，其特征在于，所述标记纳米材料的纳米材料为有机纳米材料、无机纳米材料或复合纳米材料。
6.根据权利要求3...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘帅，童朝阳，刘冰，王金玉，闫增元，王爱红，方凯，
申请(专利权)人：中国人民解放军六一六九九部队，
类型：发明
国别省市：
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