杀白细胞毒素阳性金黄色葡萄球菌的CPA引物及试剂盒和检测方法技术

本发明专利技术公开了一种杀白细胞毒素阳性金黄色葡萄球菌的CPA引物及其检测试剂盒和检测方法，针对靶点pvl设计的CPA引物包括剥离引物4s、5a，交叉扩增引物2a1s，以及特异引物2a、3a；其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1

【技术实现步骤摘要】
杀白细胞毒素阳性金黄色葡萄球菌的CPA引物及试剂盒和检测方法


[0001]本专利技术属于生物检测领域，具体涉及一种杀白细胞毒素阳性金黄色葡萄球菌的CPA引物及其检测试剂盒和检测方法。

技术介绍

[0002]金黄色葡萄球菌是临床上常见的机会致病菌之一，常寄存于人和动物的鼻腔、咽喉、体表皮肤和黏膜上。金葡菌可产生各种侵袭性酶及毒素，如杀白细胞毒素、血浆凝固酶、溶血毒素、毒性休克综合征毒素、肠毒素等。在一定条件下，金葡菌通过其各种毒力因子和侵袭酶的综合调节作用，对人体造成或加重一系列炎症感染，引起疖、毛囊炎、菌血症、菌毒血症、坏死性肺炎等疾病。
[0003]杀白细胞毒素(PVL)作为金葡菌的重要毒力因子之一，可以加重诱发各种感染。杀白细胞毒素阳性的金黄色葡萄球菌携带pvl基因，该基因存在于噬菌体基因组上，可通过噬菌体携带与金黄色葡萄球菌的染色体结合在细菌中传播，临床PVL阳性金黄色葡萄菌检出率有逐年上升的趋势。
[0004]随着分子生物学的发展，PCR、荧光定量PCR、免疫检测等现代手段引入杀白细胞毒素的快速检测中，这对金葡菌感染的早判定、早治疗起到了积极作用。然而，PCR、荧光定量PCR法易受污染导致结果假阳性，且需要配置专业的检测仪器；免疫检测法操作过程复杂，对实验人员要求高，同时成本高，不适用于我国基层医疗检测机构。交叉引物恒温扩增(crossing priming amplification,CPA)技术是一种新型核酸等温扩增技术，具有高特异性、高敏感性的特征和操作便捷、结果判定清晰等优点，在快速检测领域显示出广阔的发展前景。但CPA反应的引物设计有难度，需要在有限的产物长度中设计五条引物，且避免五条引物自身发生非特异性扩增而影响结果，因此引物的设计尤为重要。
[0005]中国专利申请CN 109735636A公开了一种PSR检测金黄色葡萄球菌杀白细胞毒素的引物、试剂盒与方法，该方法检测灵敏度不够高，检测限仅为53pg/μL，限制了应用范围。

技术实现思路

[0006]为了解决现有方法检测灵敏度不足的问题，本专利技术的目的在于提供一种杀白细胞毒素阳性金黄色葡萄球菌的CPA引物及其检测试剂盒和检测方法。
[0007]本专利技术的目的通过下述技术方案实现：
[0008]一种CPA检测引物，是针对金黄色葡萄球菌的pvl基因设计的，包括剥离引物4s、5a，交叉扩增引物2a1s，以及特异引物2a、3a；其核苷酸序列分别如下所示：
[0009]靶点pvl剥离引物4s：5
’‑
gttgggatgttgaagcac
‑3’
(SEQ ID NO.1)
[0010]靶点pvl剥离引物5a：5
’‑
tggataacactggcattt
‑3’
(SEQ ID NO.2)
[0011]靶点pvl交叉引物2a1s：5
’‑
gtccagcatttaagttgcggaccatatggcagagat
‑3’
(SEQ ID NO.3)
[0012]靶点pvl特异引物2a：5
’‑
gtccagcatttaagttgc
‑3’
(SEQ ID NO.4)
[0013]靶点pvl特异引物3a：5
’‑
catttcattaccataag
‑3’
(SEQ ID NO.5)。
[0014]一种针对杀白细胞毒素阳性金黄色葡萄球菌的检测试剂盒，包括上述的CPA检测引物；
[0015]所述试剂盒中，各CPA检测引物的浓度优选10μM；
[0016]所述的试剂盒还包括如下组分：
[0017]A、2
×
反应缓冲液：40.0mM的Tris
‑
HCl，20.0mM的硫酸铵，20.0mM的氯化钾，16.0mM的硫酸镁，0.2％(v/v)的Tween 20，1.4M的甜菜碱，10.0mM的dNTPs(each)；
[0018]B、Bst DNA聚合酶；
[0019]C、钙黄绿素和氯化锰的混合溶液；
[0020]组分B中所述的Bst DNA聚合酶优选浓度为8U/μL的Bst DNA聚合酶水溶液。
[0021]组分C中所述的钙黄绿素和氯化锰的混合溶液通过如下方法制备得到：
[0022](i)将钙黄绿素溶于二甲基亚砜(DMSO)中，配制50μM的钙黄绿素溶液；将氯化锰溶于水中，配制1mM的氯化锰水溶液；
[0023](ii)取25μL、50μM的钙黄绿素溶液与10μL、1mM的氯化锰水溶液混合均匀，得到钙黄绿素和氯化锰的混合溶液(钙黄绿素与氯化锰的质量比为1:8)。
[0024]一种针对杀白细胞毒素阳性金黄色葡萄球菌的CPA检测方法，包括如下步骤：
[0025](1)提取待检样品的细菌DNA作为模板DNA，并控制模板DNA水溶液的OD
260
/OD
280
值为1.8～2.0；
[0026](2)建立检测pvl的交叉引物恒温扩增反应体系，于60～63℃水浴中保温至少60分钟进行交叉引物恒温扩增反应，待反应完成后于(80
±
2)℃水浴中保温2～3分钟终止反应；
[0027]其中，交叉引物恒温扩增反应体系为：2
×
反应缓冲液12.5μL，10μM的剥离引物4s和10μM的剥离引物5a各1.5μL，10μM的交叉引物2a1s 2.5μL，10μM的特异引物2a和10μM的特异引物3a各1.25μL，DNA模板1.0μL，8U/μL的Bst DNA聚合酶1.0μL，加去核酸水补足至25μL；最后加入1μL的钙黄绿素与氯化锰的混合溶液；
[0028](3)针对靶点pvl的检测，终止反应后肉眼观察反应体系的颜色。待检样品为杀白细胞毒素阴性金黄色葡萄球菌或非金黄色葡萄球菌显示黄色；待检样品为杀白细胞毒素阳性金黄色葡萄球菌显示绿色；
[0029]步骤(3)优选地，终止反应后对扩增产物做琼脂糖凝胶电泳，杀白细胞毒素阳性金黄色葡萄球菌呈现梯形条带，杀白细胞毒素阴性金黄色葡萄球菌或非金黄色葡萄球菌无扩增条带。
[0030]本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0031](1)本专利技术针对金黄色葡萄球菌靶序列pvl的保守区域，设计一对剥离引物、交叉引物和特异引物构建交叉引物恒温扩增反应体系，实现了60分钟获得杀白细胞毒素检测结果，改进了现有技术检测周期长、灵敏度低、成本高、现场应用困难等不足。
[0032](2)本专利技术在满足检测可靠性的前提下，实现了高特异性和高灵敏度检测，这对于提高群体疾病和早期疾病的诊断率和准确性具有重要意义。
[0033](3)本专利技术在恒温条件下扩增，减少升温降温的时间成本。同时，该技术不需要特殊、昂贵的仪器和试剂，检测成本较低，扩增产物不需要凝胶电泳，操作简便，可以直观地用
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种CPA检测引物，其特征在于包括剥离引物4s、5a，交叉扩增引物2a1s，以及特异引物2a、3a；其核苷酸序列分别如下所示：靶点pvl剥离引物4s：5
’‑
gttgggatgttgaagcac
‑3’
(SEQ ID NO.1)靶点pvl剥离引物5a：5
’‑
tggataacactggcattt
‑3’
(SEQ ID NO.2)靶点pvl交叉引物2a1s：5
’‑
gtccagcatttaagttgcggaccatatggcagagat
‑3’
(SEQ ID NO.3)靶点pvl特异引物2a：5
’‑
gtccagcatttaagttgc
‑3’
(SEQ ID NO.4)靶点pvl特异引物3a：5
’‑
catttcattaccataag
‑3’
(SEQ ID NO.5)。2.一种针对杀白细胞毒素阳性金黄色葡萄球菌的检测试剂盒，其特征在于包括权利要求1所述的CPA检测引物。3.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于：所述各CPA检测引物的浓度为10μM。4.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于还包括如下组分：A、2
×
反应缓冲液：40.0mM的Tris
‑
HCl，20.0mM的硫酸铵，20.0mM的氯化钾，16.0mM的硫酸镁，0.2％(v/v)的Tween 20，1.4M的甜菜碱，10.0mM的dNTPs(each)；B、Bst DNA聚合酶；C、钙黄绿素和氯化锰的混合溶液。5.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于：所述Bst DNA聚合酶的浓度为8U/μL。6.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐振波，刘子奇，骆玉婷，刘君彦，陈玲，叶燕锐，李晓玺，洪玮，彭芳，付欣，户帅锋，苏健裕，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：