一种由人多能干细胞分化获得胰腺前体细胞及胰岛β细胞的方法技术

本发明专利技术公开了一种由人多能干细胞分化获得胰腺前体细胞及胰岛β细胞的方法，涉及干细胞分化在医疗中的应用技术领域，包括以下步骤：将人多能干细胞制备为多功能细胞球；培养所得多功能细胞球，使其定向分化为定型内胚层细胞；培养所得定型内胚层细胞，诱导其分化为胰腺前体细胞；培养所得胰腺前体细胞诱导其分化为胰岛β细胞。本发明专利技术通过调整各步骤培养液组分，使试验过程和结果都更加稳定，培养液更简单、成本低、易保存；单次试验结果之间差异性更小、产量更高。所得细胞质量也更加均匀、细胞性能更好。从胰腺前体细胞诱导分化为胰岛β细胞基本可以看做一步培养，在保证细胞实现有效的定向分化的前提下，节约了大量的培养时间及培养基。培养基。

【技术实现步骤摘要】
一种由人多能干细胞分化获得胰腺前体细胞及胰岛
β
细胞的方法


[0001]本专利技术涉及干细胞分化在医疗中的应用
，具体涉及一种由人多能干细胞分化获得胰腺前体细胞及胰岛β细胞的方法。

技术介绍

[0002]糖尿病是一组以高血糖为特征的代谢性疾病。高血糖则是由于胰岛素分泌缺陷或其生物作用受损，或两者兼有引起。长期存在的高血糖，导致各种组织，特别是眼、肾、心脏、血管、神经的慢性损害、功能障碍。
[0003]1型或2型糖尿病均存在明显的遗传异质性。糖尿病存在家族发病倾向，1/4
‑
1/2患者有糖尿病家族史。临床上至少有60种以上的遗传综合征可伴有糖尿病。1型糖尿病有多个DNA位点参与发病，其中以HLA抗原基因中DQ位点多态性关系最为密切。在2型糖尿病已发现多种明确的基因突变，如胰岛素基因、胰岛素受体基因、葡萄糖激酶基因、线粒体基因等。进食过多，体力活动减少导致的肥胖是2型糖尿病最主要的环境因素，使具有2型糖尿病遗传易感性的个体容易发病。1型糖尿病患者存在免疫系统异常，在某些病毒如柯萨奇病毒，风疹病毒，腮腺病毒等感染后导致自身免疫反应，破坏胰岛素β细胞。
[0004]胰岛移植是本世纪兴起的从根本上治疗糖尿病的方法，但前期主要利用胰岛分离后移植，再结合适宜的免疫抑制方案，这类方案极度依赖供体，因此不能实现大规模应用。干细胞分化近年在医疗领域的应用逐渐受到人们的重视和初步开发，也有研究开始将目光投向通过干细胞分化制备胰岛细胞，但目前研究的方法均具有重复性差、产量低等问题，无法实现实验室外的应用，更无法广泛推广到临床应用。

技术实现思路

[0005]为解决上述问题，本专利技术提供一种稳定、重复性好的，单次试验产量高的新的由人多能干细胞分化获得胰腺前体细胞及胰岛β细胞的方法，方案如下：
[0006]一种由人多能干细胞分化获得胰腺前体细胞及胰岛β细胞的方法，包括以下步骤：
[0007]S1、将人多能干细胞制备为多功能细胞球；
[0008]S2、使用培养液2培养所得多功能细胞球，使其定向分化为定型内胚层细胞；
[0009]S3、使用培养液3培养所得定型内胚层细胞，诱导其分化为胰腺前体细胞；
[0010]S4、使用培养液4培养所得胰腺前体细胞诱导其分化为胰岛β细胞。
[0011]S1所述人多能干细胞为贴壁培养的人多能干细胞。
[0012]优选地，S1所述制备步骤包括：将贴壁培养的人多功能干细胞消化成细胞小块，使用培养液1重悬后，接种于超低吸附六孔板，进行一阶段培养后，得到规则的细胞小球，然后进行3D悬浮培养，得到多功能细胞球。
[0013]优选地，S1所述培养液1未包括ROCK1抑制剂的mTeSR
‑
1完全培养液；接种密度为0.5
‑
1.0
×
106/cm2。
[0014]优选地，S1所述一阶段培养，包括：在37℃、5％氧气条件下静置培养10
‑
18h；在37℃、5％氧气条件下振荡培养3
‑
5h，所述振荡培养，条件为80
‑
100rpm；在37℃、5％氧气条件下振荡培养10
‑
15h，所述振荡培养，条件为50
‑
70rpm；在37℃、5％氧气条件下振荡培养10
‑
15h，所述振荡培养，条件为10
‑
40rpm。
[0015]优选地，S1所述3D悬浮培养，培养时间为2
‑
3天。
[0016]优选地，S2所述培养液2包括：DMEM培养基、F12培养基、1.0g/L碳酸氢钠、0.2％人血清白蛋白(HSA)、1％青霉素、1％链霉素、100ng/ml重组人激活素
‑
A(Activin A)、50ng/mLTGF
‑
β因子。
[0017]优选地，S2所述培养液2中，IMDM培养基和F12培养基体积比为1:1。
[0018]优选地，S2所述培养包括：在37℃、5％氧气条件下静置培养3
‑
8h；在37℃、5％氧气条件下振荡培养3
‑
5h，所述振荡培养，条件为30
‑
40rpm；重复上述操作，直到培养总时长达到4天，全程中每隔一天更换一次培养液。
[0019]优选地，S3所述培养液3包括：IMDM培养基、F12培养基、1.0g/L碳酸氢钠、0.2％人血清白蛋白(HSA)、0.5mM视黄酸、1
×
谷氨酰胺(GlutaMAX)、10mM葡萄糖、0.25M的维生素C、40μMSirt1抑制剂、20ng/mLEGF信号因子。
[0020]优选地，S3所述培养液3中，IMDM培养基和F12培养基体积比为1:5。
[0021]优选地，S3所述培养包括：在37℃、5％氧气条件下静置培养10
‑
15h；在37℃、5％氧气条件下振荡培养1
‑
3h，所述振荡培养，条件为10
‑
25rpm；重复上述操作，直到培养总时长达到5天，全程中每隔一天更换一次培养液。
[0022]优选地，S4所述培养液4包括：IMDM培养基、F12培养基、1.0g/L碳酸氢钠、0.2％人血清白蛋白(HSA)、1
×
谷氨酰胺(GlutaMAX)、10mM葡萄糖、2μMALK抑制剂(K02288)、10μM YO
‑
01027(Notch信号通路抑制剂)。
[0023]优选地，S4所述培养液4中，IMDM培养基和F12培养基体积比为1:5。
[0024]优选地，S4所述培养包括：在37℃、5％氧气条件下静置培养3
‑
8h；在37℃、5％氧气条件下振荡培养3
‑
5h，所述振荡培养，条件为10
‑
40rpm；重复上述操作，直到培养总时长达到4天，全程中每隔一天更换一次培养液；向培养液中添加终浓度10μM的Repsox(ALK5抑制剂)和终浓度2μM的R428(Axl抑制剂)，继续在37℃、5％氧气条件下静置培养2.5天。
[0025]有益效果
[0026]本专利技术的有益效果在于：
[0027]本专利技术在S1步骤中的一阶段培养中加入特定的培养步骤，能够获得更加适用于本专利技术后续步骤的多功能细胞球，追求的并非细胞球的尺寸、形状等表象表征参数，而是更加适用于本专利技术后续的定向分化，能够使分化更加顺利、重复性更高。
[0028]本专利技术在诱导定向分化步骤中采用的培养液中仍含有传统的重组人激活素
‑
A(Activin A)和视黄醇酸，但通过调整各步骤培养液的组分，获得了使试验过程和结果都更加稳定的适用于本专利技术的培养液，且培养液较同用途的现有培养基配方及制备方法均简单、成本低、易保存；另外通过不断优化，获得了能够使单次试验结果之间差异性更小、产量更高的培养方法。本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种由人多能干细胞分化获得胰腺前体细胞及胰岛β细胞的方法，其特征在于：包括以下步骤：S1、将人多能干细胞制备为多功能细胞球；S2、使用培养液2培养所得多功能细胞球，使其定向分化为定型内胚层细胞；S3、使用培养液3培养所得定型内胚层细胞，诱导其分化为胰腺前体细胞；S4、使用培养液4培养所得胰腺前体细胞诱导其分化为胰岛β细胞。2.根据权利要求1所述的由人多能干细胞分化获得胰腺前体细胞及胰岛β细胞的方法，其特征在于：S1所述制备步骤包括：将贴壁培养的人多功能干细胞消化成细胞小块，使用培养液1重悬后，接种于超低吸附六孔板，进行一阶段培养后，得到规则的细胞小球，然后进行3D悬浮培养，得到多功能细胞球。3.根据权利要求2所述的由人多能干细胞分化获得胰腺前体细胞及胰岛β细胞的方法，其特征在于：S1所述培养液1未包括ROCK1抑制剂的mTeSR
‑
1完全培养液；接种密度为0.5
‑
1.0
×
106/cm2。4.根据权利要求3所述的由人多能干细胞分化获得胰腺前体细胞及胰岛β细胞的方法，其特征在于：S1所述一阶段培养，包括：在37℃、5％氧气条件下静置培养10
‑
18h；在37℃、5％氧气条件下振荡培养3
‑
5h，所述振荡培养，条件为80
‑
100rpm；在37℃、5％氧气条件下振荡培养10
‑
15h，所述振荡培养，条件为50
‑
70rpm；在37℃、5％氧气条件下振荡培养10
‑
15h，所述振荡培养，条件为10
‑
40rpm；S1所述3D悬浮培养，培养时间为2
‑
3天。5.根据权利要求1所述的由人多能干细胞分化获得胰腺前体细胞及胰岛β细胞的方法，其特征在于：S2所述培养液2包括：DMEM培养基、F12培养基、1.0g/L碳酸氢钠、0.2％人血清白蛋白(HSA)、1％青霉素、1％链霉素、100ng/ml重组人激活素
‑
A(Activin A)、50ng/mLTGF
‑
β因子；S2所述培养液2中，IMDM培养基和F12培养基体积比为1:1。6.根据权利要求1所述的由人多能干细胞分化获得胰腺前体细胞及胰岛β细胞的方法，其特征在于：S2所述培养包括：在37℃、...

【专利技术属性】
技术研发人员：顾军，顾帅，兰丹，
申请(专利权)人：多能干细胞再生医学科技广州有限公司，
类型：发明
国别省市：