本发明专利技术公开了一种体外诱导干细胞分化的胰岛细胞形成胰岛样结构的方法，涉及生物技术领域，方法包括以下步骤：原料组织分离培养得到间充质干细胞；所得间充质干细胞传代培养；对所得传代间充质干细胞进行诱导分化，分化为胰岛样细胞。本发明专利技术采用特定的诱导培养基及前处理、诱导培养步骤，能够快速高效体外诱导干细胞分化的胰岛细胞形成胰岛样结构，方法诱导率高、产物细胞质量高、应用效果好。应用效果好。
【技术实现步骤摘要】
体外诱导干细胞分化的胰岛细胞形成胰岛样结构的方法
[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及一种体外诱导干细胞分化的胰岛细胞形成胰岛样结构的方法。
技术介绍
[0002]糖尿病是一组以高血糖为特征的代谢性疾病。高血糖则是由于胰岛素分泌缺陷或其生物作用受损，或两者兼有引起。长期存在的高血糖，导致各种组织，特别是眼、肾、心脏、血管、神经的慢性损害、功能障碍。
[0003]胰岛移植是本世纪兴起的从根本上治疗糖尿病的方法，但前期主要利用胰岛分离后移植，再结合适宜的免疫抑制方案，这类方案极度依赖供体，因此不能实现大规模应用。干细胞分化近年在医疗领域的应用逐渐受到人们的重视和初步开发，也有研究开始将目光投向通过干细胞分化制备胰岛细胞，但目前研究的方法均具有重复性差、产量低等问题，无法实现实验室外的应用，更无法广泛推广到临床应用。在该技术中，至关重要的是诱导干细胞向胰岛样细胞分化的部分，此部分多以间充质干细胞作为原料，间充质干细胞是中胚层中具有高度自我更新和多向分化潜能的多能干细胞，广泛存在于全身多种组织中，在一定条件下可分化为胰岛β细胞或胰岛素生成细胞。但目前这一操作步骤普遍存在阻碍细胞生长、诱导因子多、诱导周期长、残留因子种类繁多等问题，降低了整体的诱导率，并且对产品的后续应用遗留不良影响。
技术实现思路
[0004]为解决上述现有方法中存在的诱导率低以及对产品质量产生负面影响等问题，本专利技术提供一种新的能够快速高效体外诱导干细胞分化的胰岛细胞形成胰岛样结构的方法，诱导率高、产品质量高，具体方案如下：
[0005]一种体外诱导干细胞分化的胰岛细胞形成胰岛样结构的方法，包括以下步骤：
[0006]S1、从原料组织分离培养得到间充质干细胞；
[0007]S2、所得间充质干细胞传代培养；
[0008]S3、对所得传代间充质干细胞进行诱导分化，分化为胰岛样细胞。
[0009]优选地，S1所述原料组织包括胎盘组织或脂肪组织中的一种或二种。
[0010]优选地，S1所述分离培养，包括：将原料组织清洗后剪碎，使用消化酶消化，离心后获得细胞沉淀，清洗后接种于细胞培养基培养。
[0011]优选地，上述消化酶包括Ⅰ型胶原酶或Ⅱ型胶原酶，消化时间45
‑
60min。
[0012]优选地，上述离心，条件为1200
‑
1500rpm离心5
‑
8min；上述清洗，采用PBS，清洗3
‑
5次。
[0013]优选地，上述接种于细胞培养基后，于37、℃5％CO2、95％饱和湿度条件下培养。
[0014]优选地，上述培养，包括：接种后于37、℃5％CO2、95％饱和湿度条件下培养3天后更换一半培养液，再培养3天后更换全部培养液，继续培养，至细胞融合度达80％
‑
90％，除
去培养液并清洗细胞，用胰酶消化后重悬稀释，离心取细胞沉淀，用细胞培养液重悬得到间充质干细胞。
[0015]优选地，S2所述传代培养包括：所得间充质干细胞加入传代培养基，于37、℃5％CO2、95％饱和湿度条件下培养，待细胞融合度达到80％
‑
90％时，用胰蛋白酶
‑
EDTA溶液进行消化，消化完成后按1:4进行传代培养。
[0016]优选地，上述胰蛋白酶
‑
EDTA溶液包括质量浓度为0.25％的胰蛋白酶和质量浓度为0.02％的EDTA。
[0017]优选地，上述传代培养基包括：α
‑
MEM培养基、血小板衍生因子、成纤维细胞生长因子和抗坏血酸；所述血小板衍生因子的浓度为10
‑
15ng/mL；所述成纤维细胞生长因子的浓度为10
‑
15ng/mL；所述抗坏血酸的浓度为25
‑
50μg/mL。
[0018]优选地，上述传代培养，接种在直径10cm的平皿上，传代接种密度为(1
‑
2)
×
104/cm2。
[0019]优选地，S3所述传代间充质干细胞为P3代以上传代细胞。
[0020]优选地，S3所述诱导分化所用诱导培养基，基础培养基为α
‑
MEM培养基，其中包括β细胞素、EGF、尼克酰胺、人碱性成纤维细胞生长因子。
[0021]优选地，上述诱导培养基中，β细胞素浓度为3
‑
5μg/L，EGF浓度为120
‑
140pmol/L，尼克酰胺的浓度为15
‑
18mmol/L，人碱性成纤维细胞生长因子浓度为7
‑
10ug/L。
[0022]优选地，S3所述诱导分化，包括：将传代间充质干细胞接种于6孔超低吸附培养板中，每孔添加3ml诱导培养基，悬浮诱导，每3天更换诱导培养基，诱导培养时间为5
‑
9天。
[0023]优选地，上述接种密度为1.5
‑2×
105cells/孔。
[0024]优选地，S3所述诱导培养，在第一次更换诱导培养基前，除去培养基，用胰蛋白酶
‑
EDTA溶液进行消化细胞20
‑
30min，PBS缓冲液清洗细胞3
‑
5次后，每孔添加3ml诱导培养基，继续悬浮诱导，每3天更换诱导培养基，诱导培养总时间为5
‑
7天。
[0025]有益效果
[0026]本专利技术的有益效果在于：
[0027]本专利技术提供的体外诱导干细胞分化的胰岛细胞形成胰岛样结构的方法采用特定的诱导培养基及前处理、诱导培养步骤，能够快速高效体外诱导干细胞分化的胰岛细胞形成胰岛样结构，方法诱导率高、产物细胞质量高、应用效果好。
具体实施方式
[0028]以下通过特定的具体实例说明本专利技术的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本专利技术的其他优点与功效。本专利技术还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本专利技术的精神下进行各种修饰或改变。
[0029]除非特别指出，以下实施例和对比例为平行试验，采用同样的处理步骤和参数。
[0030]实施例1体外诱导干细胞分化的胰岛细胞形成胰岛样结构：
[0031]S1、从原料组织分离培养得到间充质干细胞；
[0032]S2、所得间充质干细胞传代培养；
[0033]S3、对所得传代间充质干细胞进行诱导分化，分化为胰岛样细胞。
[0034]S1所述原料组织包括人胎盘组织。
[0035]S1所述分离培养，包括：将原料组织清洗后剪碎，使用消化酶消化，离心后获得细胞沉淀，清洗后接种于细胞培养基培养。
[0036]上述消化酶包括Ⅰ型胶原酶，消化时间45min。
[0037]上述离心，条件为1200rpm离心5min；上述清洗，采用PBS，清洗3本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种体外诱导干细胞分化的胰岛细胞形成胰岛样结构的方法，其特征在于：包括以下步骤：S1、从原料组织分离培养得到间充质干细胞；S2、所得间充质干细胞传代培养；S3、对所得传代间充质干细胞进行诱导分化，分化为胰岛样细胞。2.根据权利要求1所述的体外诱导干细胞分化的胰岛细胞形成胰岛样结构的方法，其特征在于：S1所述原料组织包括胎盘组织或脂肪组织中的一种或二种；S1所述分离培养，包括：将原料组织清洗后剪碎，使用消化酶消化，离心后获得细胞沉淀，清洗后接种于细胞培养基培养。3.根据权利要求2所述的体外诱导干细胞分化的胰岛细胞形成胰岛样结构的方法，其特征在于：S1所述消化酶包括Ⅰ型胶原酶或Ⅱ型胶原酶，消化时间45
‑
60min；上述离心，条件为1200
‑
1500rpm离心5
‑
8min；上述清洗，采用PBS，清洗3
‑
5次。4.根据权利要求3所述的体外诱导干细胞分化的胰岛细胞形成胰岛样结构的方法，其特征在于：S1所述培养，包括：接种后于37℃、5％CO2、95％饱和湿度条件下培养3天后更换一半培养液，再培养3天后更换全部培养液，继续培养，至细胞融合度达80％
‑
90％，除去培养液并清洗细胞，用胰酶消化后重悬稀释，离心取细胞沉淀，用细胞培养液重悬得到间充质干细胞。5.根据权利要求1所述的体外诱导干细胞分化的胰岛细胞形成胰岛样结构的方法，其特征在于：S2所述传代培养包括：所得间充质干细胞加入传代培养基，于37℃、5％CO2、95％饱和湿度条件下培养，待细胞融合度达到80％
‑
90％时，用胰蛋白酶
‑
EDTA溶液进行消化，消化完成后按1:4进行传代培养。6.根据权利要求5所述的体外诱导干细胞分化的胰岛细胞形成胰岛样结构的方法，其特征在于：S2所述传代培养基包括：α
‑
MEM培养基、血小板衍生因子、成纤维...
【专利技术属性】
技术研发人员：顾军，顾帅，兰丹，
申请(专利权)人：多能干细胞再生医学科技广州有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。