一种cRGD-季铵化壳寡糖修饰的ES2肽-甲氨蝶呤结合物、其制备方法及应用技术

本发明专利技术涉及一种cRGD

【技术实现步骤摘要】
一种cRGD
‑
季铵化壳寡糖修饰的ES2肽
‑
甲氨蝶呤结合物、其制备方法及应用


[0001]本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种cRGD
‑
季铵化壳寡糖修饰的ES2肽
‑
甲氨蝶呤结合物及所述结合物的制备方法，还提供了包括所述cRGD
‑
季铵化壳寡糖修饰的ES2肽
‑
甲氨蝶呤结合物的组合物及所述结合物、组合物的应用。

技术介绍

[0002]公开该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
[0003]内皮抑素(Endostatin，ES)是从一种从小鼠内皮细胞瘤上清中分离纯化获得的内源性新生血管生成抑制剂，可通过抑制肿瘤组织新生血管的生成，切断肿瘤营养供给途径和废物代谢途径，从而起到抗肿瘤的作用。另外，ES对糖尿病眼部并发症、类风湿性关节炎等其他与新生血管生成有关的疾病也展现出一定的治疗效果。
[0004]ES结构中有一短肽段为ES2(IVRRADRAAVP)，是一段由11个氨基酸组成的多肽序列，包含ES中的氨基酸60
‑
70序列和三个表面暴露的精氨酸残基Arg
62
，Arg
63
和Arg
66
。ES2同样具有明显的抗新生血管生成活性和抗肿瘤活性，且更容易通过固相合成的方式获得。但ES2也存在稳定性差、细胞亲和力低、活性不稳定和半衰期短等缺点，研究表明，通过化学修饰的手段有望改善这些缺点。
[0005]壳寡糖(Chitosan oligosaccharide,COS)学名β
‑
1,4
‑
寡糖
‑
葡萄糖胺，是将壳聚糖经特殊的生物酶技术降解得到的一种聚合度在2～20之间的寡糖产品，其水溶性较好、生物利用度较高，无毒副作用，安全可靠。它具有壳聚糖所没有的高水溶性和容易被生物体降解等特性。此外，壳寡糖在抑菌、抗氧化、抗炎、调节血脂和血糖、抗肿瘤、增强免疫力及活化肠道菌群等方面表现出较好的活性。
[0006]整合素是一类细胞粘附受体，调节细胞
‑
细胞，细胞
‑
细胞外基质的相互作用，能够直接或间接影响细胞迁移、细胞行为，细胞增殖，细胞生长，血管生成，细胞存活，侵袭和肿瘤发生。整合素蛋白为RGD的常见受体，可以与RGD发生特异性结合。整合素在肿瘤细胞和肿瘤新生血管内皮细胞中过表达，从而可以用特定RGD序列靶向于该类细胞。
[0007]RGD是一种含有精氨酸、甘氨酸和天冬氨酸的三肽序列，是整合素与其配体蛋白相互作用的识别位点，介导细胞与胞外基质及细胞间的黏附作用，同时具有信号传导功能，从而介导许多重要的生命活动。RGD肽及其衍生物，能够特异性识别细胞表面的整合素受体蛋白(如αvβ3、α5β1等)并与之结合。使用RGD序列来进行靶向的药物递送已被广泛的研究。

技术实现思路

[0008]针对现有技术的不足，本专利技术提供一种靶向整合素αvβ3的ES2肽的cRGD
‑
季铵化壳寡糖修饰并联合甲氨蝶呤的结合物的制备方法。本专利技术通过优化控制反应相关参数和条
件，从而成功制备得到季铵化壳寡糖
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cRGD
‑
ES2肽结合物和/或季铵化壳寡糖
‑
cRGD
‑
ES2肽
‑
甲氨蝶呤结合物，其具有良好的稳定性和生物活性，因此具有良好的实际应用之价值。
[0009]本专利技术提供以下技术方案：
[0010]本专利技术第一方面，提供一种cRGD
‑
季铵化壳寡糖修饰的ES2肽
‑
甲氨蝶呤结合物，所述结合物中，季铵化壳寡糖(QCOS)、cRGD、ES2肽及甲氨蝶呤(MTX)通过酰胺键连接，其结构式如下：
[0011]QCOS
‑
(cRGD)n1‑
(ES2)n2‑
(MTX)n3；
[0012]式中，n1＝1～10，n2＝1～10，n3＝1～10；季铵化壳寡糖的分子量小于3000Da。
[0013]本专利技术提供了一种ES2肽的cRGD
‑
季铵化壳寡糖修饰物，针对ES2肽不稳定的缺陷，通过cRGD和季铵化壳寡糖修饰改善了ES2肽的稳定性，并且具有良好的新生血管抑制作用，同时提高了ES2肽靶向肿瘤细胞和新生血管细胞的能力，可应用于抗肿瘤药物或视网膜病变的治疗等。甲氨蝶呤属于抗叶酸类抗肿瘤药物，但溶解性不佳，本专利技术设计采用上述ES2肽的cRGD
‑
季铵化壳寡糖修饰物与甲氨蝶呤联合，解决了甲氨蝶呤在溶解性方面的缺陷，期望获得一种抗肿瘤效果更好的活性成分。经验证，上述结合物相增加了ES2肽的稳定性和抗肿瘤效果，并且，经本专利技术验证，在经过RGD环肽修饰后，所述结合物的肿瘤靶向性也得到了明显提升。
[0014]本专利技术第二方面，提供第一方面所述cRGD
‑
季铵化壳寡糖修饰的ES2肽
‑
甲氨蝶呤结合物的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：活化cRGD的羧基部分，碱性条件下加入季铵化壳寡糖(QCOS)反应得到CR结合物；将活化后的ES2肽后与CR结合物偶联得到CRE结合物；将甲氨蝶呤溶于碱性溶液中，催化作用下与所述CRE结合物偶联得到上述cRGD
‑
季铵化壳寡糖修饰的ES2肽
‑
甲氨蝶呤结合物(CREM)。
[0015]本专利技术第三方面，提供一种组合物，所述组合物中，第一方面所述cRGD
‑
季铵化壳寡糖修饰的ES2肽
‑
甲氨蝶呤结合物作为活性成分。
[0016]本专利技术第四面，提供第一方面所述cRGD
‑
季铵化壳寡糖修饰的ES2肽
‑
甲氨蝶呤结合物、第三方面组合物在制备增强机体免疫力、抗氧化、抗炎、抗菌、抗新生血管生成和/或抗肿瘤等相关疾病的产品中的应用。
[0017]上述结合物中，ES2肽、壳寡糖的生理活性是多个方面的，包括机体免疫力调节、抗菌、抗炎，预防心血管疾病、肿瘤及改善胃肠道等。甲氨蝶呤作为一种抗肿瘤药物可能引起胃肠道反应甚至肝功能的损伤，而上述结合物在物理性质方面能够改善甲氨蝶呤溶解度的缺陷，在生理活性方面还可以很好的弥补甲氨蝶呤带来的副作用，降低甲氨蝶呤带来的不良反应。
[0018]以上一个或多个技术方案的有益效果是：
[0019]上述技术方案制备的CRE/CREM结合物与ES2肽相比，其稳定性更高，生物活性更强，因此具有良好的实际应用之价值。
附图说明
[0020]构成本专利技术的一部分的说明书附图用来提供对本专利技术的进一步理解，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。
[0021]图1为实施例1中所本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种cRGD
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季铵化壳寡糖修饰的ES2肽
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甲氨蝶呤结合物，其特征在于，所述结合物中，季铵化壳寡糖、cRGD、ES2肽及甲氨蝶呤通过酰胺键连接，其结构式如下：QCOS
‑
(cRGD)n1‑
(ES2)n2‑
(MTX)n3；式中，n1＝1～10，n2＝1～10，n3＝1～10；季铵化壳寡糖的分子量小于3000Da。2.如权利要求1所述cRGD
‑
季铵化壳寡糖修饰的ES2肽
‑
甲氨蝶呤结合物，其特征在于，所述季铵化壳寡糖的取代度为4～7，优选的，为4或5或6，进一步的，取代度为5；或，所述cRGD肽，为一种环肽，序列为cyclo(Arg
‑
Gly
‑
Asp
‑
d
‑
Phe
‑
Cys)；或，所述ES2肽的氨基酸序列为：IVRRADRAAVP。3.如权利要求1所述cRGD
‑
季铵化壳寡糖修饰的ES2肽
‑
甲氨蝶呤结合物，其特征在于，所述n1＝1～6；优选的，所述结合物中，cRGD的个数为2，3或4个；或，所述n2＝1～6；优选的，所述结合物中，ES2的个数为2，3或4个；或，所述n3＝1～6；优选的，所述结合物中，MTX的个数为2，3或4个；进一步的，所述cRGD
‑
季铵化壳寡糖修饰的ES2肽
‑
甲氨蝶呤结合物的制备方法如下：4.权利要求1
‑
3任一项所述cRGD
‑
季铵化壳寡糖修饰的ES2肽
‑
甲氨蝶呤结合物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：活化cRGD的羧基部分，碱性条件下加入季铵化壳寡糖反应得到CR结合物；将活化后的ES2肽后与CR结合物偶联得到CRE结合物；将甲氨蝶呤溶于碱性溶液中，催化作用下与所述CRE结合物偶联得到上述cRGD
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季铵化壳寡糖修饰的ES2肽
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甲氨蝶呤结合物。5.如权利要求4所述cRGD
‑
季铵化壳寡糖修饰的ES2肽
‑
甲氨蝶呤结合物的制备方法，其特征在于，CR结合物的具体制备方法如下：向cRGD水溶液中加入1
‑
乙基
‑
3(3
‑
二甲基丙胺)碳二亚胺和N
‑
羟基琥珀酰亚胺作为催化剂活化cRGD中的羧基，活化完成后调节pH至弱碱性，然后缓慢加入QCOS溶液进行反应，反应完成后，反应产物经纯化即得CR结合物；进一步的，EDCI和NHS催化剂的质量比为1～3：0.5～1.5；进一步的，所述弱碱性为pH值7～8.0；进一步的，所述QCOS溶液加入cRGD水溶液后缓慢搅拌，反应20～25h后结束反应；进一步的，所述纯化可采用柱色谱、透析等常规方式，具体的，采用截留分子量为1000Da的透析袋进行纯化得到CR结合物；
具体的，所述CR结合物的制备方法如下：将cRGD溶于双蒸水中，获得cRGD溶液，然后向其中加入EDCI和NHS催化剂，比例为2：1，混匀，于室温条件下缓慢搅拌，搅拌完成后调pH值至7.40；用双蒸水溶解QCOS，将QCOS溶液逐滴加入到cRGD溶液中，缓慢搅拌反应24h，反应完成后，将反应液转移到截留分子量为1000Da的透析袋中用双蒸水透析两天，除去杂质；透析完成后，收集反应液放入冷冻干燥机中冻干，获得CR结合物；或，所述CRE结合物的制备方法如下：向ES2的水溶液中加入EDCI和NHS进行活化后，缓慢加入上述CR溶液继续反应，反应结束后，反应产物经纯化后即得CRE结合物；进一步的，活化时间为0.8～1.2h；进一步的，所述加入CR溶液后室温条件下反应20～25h；进一步的，所述纯化可采用柱色谱、透析等常规方式；具体的，采用截留分子量为1000Da的透析袋透析纯化得到CRE结合物；具体的，所述CRE结合物的制备方法如下：将ES2短肽溶于双蒸水中，获得ES2溶...

【专利技术属性】
技术研发人员：谭海宁，孙凤，唐雯，李妍，侯慧文，王洁，符家爱，卢鲁，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：