一种农杆菌介导的棉花遗传转化方法技术

本发明专利技术提供了一种棉花遗传转化方法，所述方法包括从浸泡后的棉花成熟种子中剥取的叶原基下部的茎尖分生组织为遗传转化受体，在超声波处理条件下，用含有目的DNA的重组根癌农杆菌侵染所述遗传转化受体，得到侵染后的外植体，培养所述侵染后的外植体，得到转基因棉花植株。本发明专利技术具有操作简单，生长周期短，重复性好，受体基因型限制小，转化方式统一简便，转化效率高，获得的转基因棉花植株遗传稳定性好等优点。优点。优点。

【技术实现步骤摘要】
一种农杆菌介导的棉花遗传转化方法


[0001]本专利技术涉及生物
中一种棉花遗传转化方法，特别涉及一种农杆菌介导的棉花遗传转化方法。

技术介绍

[0002]棉花是世界上最重要的天然纤维来源和经济作物之一。棉花全基因组测序的完成使得确认和分离大量基因更加快捷简便，近年来兴起的基因组编辑技术提供了简单、精准的基因改良手段，成为生命科学领域颠覆性的技术突破。而基因功能的验证需要将这些基因转化到棉花中验证候选基因的实用性。目前常规的棉花遗传转化方法是通过基因枪轰击和农杆菌浸染后通过组织培养途径获得转基因植株，这一过程通常需要 10
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11个月左右，不仅费时费力，而且只适用于少数棉花品种。而基因编辑需要成熟、稳定、高效的再生体系。但当前推广种植的棉花品种严重受到基因型的限制，基本上都不能进行农杆菌介导的遗传转化；即使能够进行遗传转化的品种，也存在着转化周期长、体细胞胚畸形率高和正常再生苗数量少等问题，绝大多数具有重要经济价值的棉花品种，其基因型差异较大，再生性能差，仍然难以进行转化，因此，建立一个转化受体基因型依赖程度较低的棉花遗传转化方法具有重大意义。

技术实现思路

[0003]针对目前棉花转基因过程中转化受体基因型依赖程度较高的现状，本专利技术的目的是提供一种转化受体基因型依赖程度较低的棉花遗传转化方法。
[0004]本专利技术提供的棉花遗传转化的方法，包括从浸泡后的棉花成熟种子中剥取的叶原基下部的茎尖分生组织为遗传转化受体，在超声波处理条件下，用含有目的DNA的重组根癌农杆菌侵染所述遗传转化受体，得到侵染后的外植体，培养所述侵染后的外植体，得到转基因棉花植株。
[0005]上述方法中，所述培养所述侵染后的外植体不包括愈伤组织增殖、胚性愈伤组织诱导、愈伤组织继代、愈伤组织筛选、芽诱导和/或根诱导。
[0006]上述方法中，所述超声波处理，频率为40
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100kHz，时长40
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80s。优选频率为40 kHz，时长40s。
[0007]上述方法中，所述浸泡为用MSB液体培养基浸泡所述棉花成熟种子18
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24小时。
[0008]其中，所述MSB液体培养基的pH值为5.6，组成为：MS盐和B5维生素的混合物浓度为4.4g/L，葡萄糖浓度为20g/L，葡萄酸钙浓度为1.29g/L，其余为水；所述MS盐和维生素B5的混合物由如下重量份的原料组成：硝酸钾1900重量份，硝酸铵 1650重量份，磷酸二氢钾170重量份，二水硝酸钙598重量份，无水硫酸镁181重量份，七水硫酸亚铁27.85重量份，EDTA
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na 37.3重量份，一水硫酸锰17.1重量份，碘化钾0.83重量份，硼酸6.2重量份，二水钼酸钠0.25重量份，改性钴0.02重量份，五水硫酸铜0.025重量份，肌醇100重量份，甘氨酸2重量份，VB1 0.1重量份，VB6 0.5 重量份，VB30.5重量份。
[0009]上述方法中，所述侵染在含有乙酰丁香酮的侵染培养基中进行。
[0010]其中，所述侵染培养基的pH值为5.4，组成为：CA母液浓度为10ml/L，葡萄糖浓度为30g/L，MES浓度为4.2g/L，B5维生素浓度为0.1ml/L，6
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BA浓度为1mg/L， NAA浓度为0.1mg/L，乙酰丁香酮浓度为0.2mM，其余为水；所述CA母液的组成为： 10g/L硫酸镁，5.36g/L硫酸铵，6g/L一水合磷酸钠，6g/L氯化钙，30mg/L硼酸，100mg/L 硫酸锰，20mg/L七水合硫酸锌，7.5mg/L碘化钾，2.5mg/L二水合钼酸钠，250μg/L硫酸铜，250μg/L六水合氯化钴，100g/L硝酸钾，其余为水。
[0011]上述方法中，所述重组根癌农杆菌含有壮观霉素抗性基因(可为aada基因，其核苷酸序列如序列表中序列2所示)，所述方法还包括对所述侵染后的外植体用壮观霉素进行筛选的步骤。
[0012]上述方法中，所述培养所述侵染后的外植体包括如下步骤：
[0013]将所述侵染后的外植体转入共培养基，在黑暗条件下共培养3
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4d；
[0014]将共培养后的外植体转入恢复培养基进行恢复培养；
[0015]将恢复培养后的外植体切去根部，移人芽诱导培养基进行筛选诱导；
[0016]将筛选诱导后的外植体转入伸长培养基进行伸长培养，得到转化植株。
[0017]其中，所述芽诱导培养基的pH值为5.6，组成为所述MS盐和B5维生素的混合物浓度为4.4g/L，葡萄糖浓度为20g/L，葡萄酸钙浓度为1.29g/L，6
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BA浓度为1mg/L， NAA浓度为0.1mg/L，羧苄青霉素浓度为100mg/L，头孢霉素浓度为100mg/L，壮观霉素浓度为100mg/L，4g/L琼脂(可以合适量的其它凝固剂替换)，其余为水；
[0018]所述伸长培养基的的pH值为5.6，组成为：MS盐和B5维生素的混合物浓度为 4.4g/L，葡萄糖浓度为20g/L，葡萄酸钙浓度为1.29g/L，羧苄青霉素浓度为100mg/L，头孢霉素浓度为100mg/L，壮观霉素浓度为100mg/L，4g/L琼脂(可以合适量的其它凝固剂替换)，其余为水；
[0019]所述共培养基pH值为5.4的，组成为：所述CA母液浓度为10ml/L，葡萄糖浓度为30g/L，MES浓度为4.2g/L，B5维生素浓度为0.1ml/L，6
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BA浓度为1mg/L， NAA浓度为0.1mg/L，乙酰丁香酮浓度为0.2mM，半胱氨酸浓度为200mg/ml，其余为水；
[0020]所述恢复培养基pH值为5.6，组成为：MS盐和B5维生素的混合物浓度为4.4g/L，葡萄糖浓度为20g/L，葡萄酸钙浓度为1.29g/L，6
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BA浓度为1mg/L，NAA浓度为 0.1mg/L，羧苄青霉素浓度为100mg/L，头孢霉素浓度为100mg/L，4g/L琼脂(可以合适量的其它凝固剂替换)，其余为水。
[0021]上述方法中，所述棉花可为陆地棉或海岛棉。所述陆地棉可选自中棉所49、中棉所88、中棉所59、百棉1号和TM
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1中的任一种。所述海岛棉可选自新海43和新海 56中的任一种。
[0022]本专利技术还提供所述棉花遗传转化的方法在棉花育种中的应用。
[0023]本专利技术以棉花成熟种子为材料，经过浸泡后，剥除种皮和子叶，暴露出茎尖分生组织，以此为受体，利用农杆菌介导，采用超声波处理将外源基因导入到棉花基因组，从而获得转基因棉花。本专利技术突破了基因型限制，能够在较短的时间内高效转化执拗型陆地棉/海岛棉品种，解决了棉花遗传转化的瓶颈问题。本专利技术无需经过组织培养，受基因型影响程度低，能够快速获得转基因棉花植株，具有以下优点：操作简单，生长周期短(从浸种到获得转
基因植株，只需要88天)，重复性好，受体基因型限制小，转化方式统一简便本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种棉花遗传转化的方法，其特征在于：所述方法包括从浸泡后的棉花成熟种子中剥取的叶原基下部的茎尖分生组织为遗传转化受体，在超声波处理条件下，用含有目的DNA的重组根癌农杆菌侵染所述遗传转化受体，得到侵染后的外植体，培养所述侵染后的外植体，得到转基因棉花植株。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述超声波处理的超声功率为72W，超声频率为40
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100kHz，超声时间为40
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80s。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述浸泡为用MSB液体培养基浸泡所述棉花成熟种子18
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24小时。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述MSB液体培养基的pH值为5.6，组成为：MS盐和B5维生素的混合物浓度为4.4g/L，葡萄糖浓度为20g/L，葡萄酸钙浓度为1.29g/L，其余为水；所述MS盐和维生素B5的混合物由如下重量份的原料组成：硝酸钾1900重量份，硝酸铵1650重量份，磷酸二氢钾170重量份，二水硝酸钙598重量份，无水硫酸镁181重量份，七水硫酸亚铁27.85重量份，EDTA
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na 37.3重量份，一水硫酸锰17.1重量份，碘化钾0.83重量份，硼酸6.2重量份，二水钼酸钠0.25重量份，改性钴0.02重量份，五水硫酸铜0.025重量份，肌醇100重量份，甘氨酸2重量份，VB1 0.1重量份，VB6 0.5重量份，VB3 0.5重量份。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述侵染在含有乙酰丁香酮的侵染培养基中进行。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述侵染培养基的pH值为5.4，组成为：CA母液浓度为10ml/L，葡萄糖浓度为30g/L，MES浓度为4.2g/L，B5维生素浓度为0.1ml/L，6
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BA浓度为1mg/L，NAA浓度为0.1mg/L，乙酰丁香酮浓度为0.2mM，其余为水；所述CA母液的组成为：10g/L硫酸镁，5.36g/L硫酸铵，6g/L一水合磷酸钠，6g/L氯化钙，30mg/L硼酸，100mg/L硫酸锰，20mg/L七水合硫酸锌，7.5mg/L碘化钾，2.5mg/L二水合钼酸钠，250μg/L硫酸铜，250μg/L六...

【专利技术属性】
技术研发人员：李付广，葛晓阳，王晔，陈艳丽，许洁婷，杨晓凤，
申请(专利权)人：未米生物科技江苏有限公司，
类型：发明
国别省市：