可视化CRISPR/Cas9基因编辑系统及使用方法技术方案

本发明专利技术公开了一种可视化CRISPR/Cas9基因编辑系统，包括基因编辑元件、外源T

【技术实现步骤摘要】
可视化CRISPR/Cas9基因编辑系统及使用方法


[0001]本专利技术涉及基因工程
，尤其涉及一种可视化CRISPR/Cas9基因编辑系统及使用方法。

技术介绍

[0002]目前，已经开发了多个经典的适用于植物基因编辑的CRISPR/Cas9系统。由于CRISPR/Cas9系统具有操作简单、高效和可控的特性，已被广泛用于作物遗传育种改良。但是在作物中利用CRISPR/Cas9系统进行基因编辑育种，仍然存在前期阳性转基因植株筛选工作量大而繁琐、后期筛选非转基因突变体周期长而困难等问题。尤其是在筛选不含转基因突变体的过程中，主要通过自交或者回交来剔除携带Cas9基因元件的外源T
‑
DNA区，利用该方式获得不含转基因的基因编辑植株，一般需要种植2代以上才能获得稳定突变单株，时间跨度往往在2年以上甚至更久。另外，研究人员也尝试了利用基因枪和纳米颗粒将Cas9蛋白和gRNA直接导入植物细胞中或利用农杆菌介导的转基因瞬时表达Cas9蛋白和gRNA等方法，来避免Cas9基因等原件整合至基因组中，从而获得非转基因的基因编辑植株。但上本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种可视化CRISPR/Cas9基因编辑系统，其特征在于，包括基因编辑元件、外源T
‑
DNA可视化追踪元件和转基因花粉失活元件，所述基因编辑元件、外源T
‑
DNA可视化追踪元件和转基因花粉失活元件构建到表达载体的同一个T
‑
DNA区中；所述转基因花粉失活元件为玉米α
‑
淀粉酶基因ZMAA1的表达框，由花粉特异性启动子Pg47驱动ZMAA1基因，由IN2
‑
1终止子终止；所述花粉特异性启动子Pg47的DNA序列如SEQ ID NO.12所示；所述ZMAA1基因的DNA序列如SEQ ID NO.13所示；所述IN2
‑
1终止子的DNA序列如SEQ ID NO.14所示。2.根据权利要求1所述的可视化CRISPR/Cas9基因编辑系统，其特征在于，所述基因编辑元件为CRISPR/Cas9表达结构，CRISPR/Cas9表达结构包括Cas9基因表达框和gRNA表达框。3.根据权利要求2所述的可视化CRISPR/Cas9基因编辑系统，其特征在于，所述Cas9基因表达框由Ubi启动子驱动Cas9基因，由NOS终止子终止；所述Ubi启动子的DNA序列如SEQ ID NO.1所示；所述Cas9基因的DNA序列如SEQ ID NO.2所示；所述NOS终止子的DNA序列如SEQ ID NO.3所示。4.根据权利要求2所述的可视化CRISPR/Cas9基因编辑系统，其特征在于，所述gRNA表达框包括小RNA启动子和guide
‑
RNA，所述小RNA启动子和guide
‑
RNA之间用间隔序列隔开；所述小RNA启动子为OsU3、OsU6a、OsU6b、OsU6c中的一种；所述OsU3的DNA序列如SEQ ID NO.4所示；所述OsU6a的DNA序列如SEQ ID NO.5所示；所述OsU6b的DNA序列如SEQ ID NO.6所示；所述OsU6c的DNA序列如SEQ ID NO.7所示；所述guide
‑
RNA序列如SEQ ID NO.8所示；所述间隔序列的DNA序列SEQ ID NO.15所示。5.根据权利要求1所述的可视化CRISPR/Cas9基因编辑系统，其特征在于，所述外源T
‑
DNA可视化追踪元件为红色荧光蛋白基因DsRed的表达框，由胚乳特异性启动子ltp驱动DsRed基因，由PINII终止子终止；所述胚乳特异性启动子ltp的DNA序列如SEQ ID NO.9所示；所述DsRed基因的DNA序列如SEQ ID NO.10所示；所述PINII终止子的DNA序列如SEQ ID NO.11所示。6.根据权利要求1至5所述的可视化CRISPR/Cas9基因编辑系统，其特征在于，在转基因花粉失活元件和外源T
‑
DNA可视化追踪元件之间引入酶促组装入口序列；所述酶促组装入口序列的DNA序列如SEQ ID NO.16所示。7.一种权利要求1至6中任一项所述可视化CRISPR/Cas9基因编辑系统的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、根据待剔除基因的靶位点设计接头引物序列，合成靶位点重组接头T1
‑
Adapter和T2

【专利技术属性】
技术研发人员：余东，袁定阳，段美娟，周天顺，刘玲，刘海，孙学武，孙志忠，刘次桃，谭炎宁，盛夏冰，陈劲，袁贵龙，
申请(专利权)人：湖南农业大学，
类型：发明
国别省市：