一种抗HE4的纳米抗体1D9及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种抗HE4的纳米抗体，所述纳米抗体具有独特的3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3，该抗体亲和力可达到1.193E

【技术实现步骤摘要】
一种抗HE4的纳米抗体1D9及其应用


[0001]本专利技术公开了一种纳米抗体，属于免疫学领域。

技术介绍

[0002]卵巢上皮癌(Endometrioid Ovarian Cancer，EOC)是常见的女性生殖器官恶性肿瘤，在女性恶性肿瘤中其发病率位居第三，然而因其发现时大多处于晚期、预后差且复发率高，其死亡率却位居首位。人附睾蛋白(HE4)是一种新的卵巢癌特异性肿瘤标志物，属于乳清酸性蛋白家族(WAP)，是由WFDC2基因编码的一种分泌型小分子糖蛋白。分子量为13kDa左右，其成熟后以25kDa糖基化形式存在，主要在卵巢上皮癌、子宫内膜癌中过量表达，并且其血清水平预测卵巢癌的灵敏度明显高于CA125，尤其是在早期，检测临界值可达150pmol/L。卢仁泉等(HE4在卵巢癌诊治中的临床应用评价，中国癌症杂志，2010年20卷9期)在早年间对EOC患者的研究中就发现HE4对EOC诊断的灵敏度为72.4％，特异度为90.1％，准确性83.6％，阳性和阴性符合率分别为80.8％和85.0％，可见HE4完全可满足EOC辅助诊断的要求。朱振宁等(HE4联合CA125在卵巢癌早期诊断中的应用价值，现代肿瘤医学，2014年22卷3期)比较研究了HE4和CA125用于卵巢癌早期诊断的差异，结果显示，在早期卵巢癌组中，HE4水平显著高于健康对照组及良性肿瘤组，具有统计学意义(P＜0.05)，CA125水平在早期卵巢癌组和良性肿瘤组中无显著差异。此前Moore等(Moore RG等，Serum HE4 levels are less frequently elevated than CA125 in women with benign gynecologic disorders，American Journal of Obstetrics&Gynecology，2012年206卷4期)也曾报道HE4是鉴别卵巢癌和良性肿瘤的最好指标。此外，朱振宁等(HE4联合CA125在卵巢癌早期诊断中的应用价值，现代肿瘤医学，2014年22卷3期)的研究中HE4的敏感性和特异性分别为85％和96％，而CA125相应仅为65％和76％，可见HE4指标的优越性。HE4不仅在卵巢癌的早期诊断具有巨大潜力，其在预后评价和疗效监测方面也有重要价值。2008年FDA批准将HE4用于EOC患者的疗效评估和复发监测。大量研究也证实了HE4在这方面的性能优势。有研究者将血清HE4水平成功用于卵巢癌病人的疗效预测，通过与CA72
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4和CA125结合，可用于卵巢癌随访的复发监测。结合MDCT，HE4还可用于跟踪进展期卵巢癌患者的淋巴结转移状态。
[0003]对癌症生物标志物的敏感检测在过去几十年里引起了巨大的研究兴趣，因为它在癌症的早期诊断和治疗预后中起着重要的作用。免疫分析由于特异性和稳定性的优势，广泛应用于癌症生物标志物的敏感检测，尤其，基于抗原抗体相互作用的免疫分析方法是检测肿瘤标志物的可靠工具，并用于基础研究和临床检测。在许多研究团体的研究共同努力，目前，已开发出了多种类型的免疫分析方法：包括电泳免疫分析法、酶联免疫吸附分析法、化学发光免疫分析法、荧光免疫分析法、比色法免疫分析法、质谱免疫分析法、表面拉曼增强光谱免疫分析。化学发光免疫分析法的灵敏度和精确度比酶联免疫吸附法、荧光法高几个数量级，且具有方法稳定快速、检测范围宽、操作简单自动化程度高等优点，可用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等相关物质的检测分析。
[0004]基于HE4在临床诊断方面所表现出的突出特性，研发出针对HE4的特异性结合抗体
显得尤为重要。
[0005]1993年，Hamers
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Casterman等研究发现，在骆驼科动物(骆驼，单峰骆驼和美洲驼)的体内发现了一类仅有重链二聚体(H2)的抗体，其主要是IgG2和IgG3类型，此类抗体由于缺乏轻链，于是将这种抗体称为仅有重链的抗体(Heavy chain only like Antibody，HCAbs)，而它们的抗原结合部位由一个结构域组成，称为VHH区，因此该类抗体也被称为单结构域抗体或者单域抗体(sdAb)。由于该类抗体为去除恒定区后的可变区序列，分子量只有15kDa，大约10纳米的直径，因此也被称为纳米抗体(Nbs)。另外，在鲨鱼中也观察到这类单结构域抗体，称为VNAR。这种仅有重链的抗体原来只是作为一种人类B细胞增生性疾病(重链病)的病理形式被人们所认识。这种仅有重链的抗体可能是由于基因组水平的突变和缺失而导致重链CH1结构域不能表达，使得表达出的重链缺乏CH1，从而缺乏与轻链的结合能力，因此形成一种重链二聚体。
[0006]相对于常规的四链抗体的scFv而言，纳米抗体在亲和力方面与其对应的scFv相当，但在可溶性、稳定性、对聚集的抗性、可重折叠性、表达产率以及DNA操作、文库构建和3
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D结构测定的容易性方面超越scFv。
[0007]纳米抗体有来源于成年骆驼体内HCAbs的最小的功能性抗原结合片段，具有高度稳定性和与抗原结合的高亲合力，能与蛋白裂隙和酶活性位点相互作用，使之作用类似于抑制剂。因此，纳米抗体可以为从肽模拟药物设计小分子酶抑制物提供新的思路。由于仅有重链，纳米抗体的制造较单克隆抗体容易。纳米抗体的独特性质，如处于极端温度和pH环境中的稳定性，可以低成本制造大产量。因此，纳米抗体在疾病的治疗和诊断中具有很大的价值及发展前景。
[0008]鉴于HE4分子量较小，常规抗体与之结合难以充分识别一些隐匿于裂隙或空腔里的抗原决定簇，如果抗体识别抗原决定簇过于单一或者位点过于接近或者重叠，都会导致特异性的抗原抗体结合反应收到影响，从而严重影响检测效率。因此研发抗HE4的纳米抗体，充分发挥纳米抗体超强的抗原识别能力成为抗体
的一种新的需求。本专利技术的目的就是提供一种能够充分发挥纳米抗体的优越性能，又能克服其固有缺陷的抗HE4的纳米抗体，即所述抗体既具有高度特异的抗原识别能力，具有高度的亲和力，并且具有独特的抗原决定簇识别位点，能够在HE4抗原的免疫检测特别是双抗体夹心法中获得优异的检测效率。

技术实现思路

[0009]基于上述专利技术目的，本专利技术首先提供了一种抗HE4的纳米抗体，所述纳米抗体的可变区具有3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3，其中，CDR1序列由SEQ ID NO.1所述氨基酸序列组成，CDR2序列由SEQ ID NO.2所述氨基酸序列组成，CDR3序列由SEQ ID NO.3所述氨基酸序列组成。
[0010]在一个优选的技术方案中，所述纳米抗体的可变区序列由SEQ ID NO.4所述氨基酸序列组成。在本专利技术中具有该可变区序列的纳米抗体的一个优选实施例为纳米抗体1D9。
[0011]其次，本专利技术还提供了一种编码上述纳米抗体的核酸，所述编码序列由SEQ ID NO.5所示。
[0012]第三，本专利技术提供了一种含有上述核酸的表达载体，所述表达载体为pMES4。...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗HE4的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的可变区具有3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3，其中，CDR1序列由SEQ ID NO.1所述氨基酸序列组成，CDR2序列由SEQ ID NO.2所述氨基酸序列组成，CDR3序列由SEQ ID NO.3所述氨基酸序列组成。2.根据权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的可变区序列由SEQ ID NO.4所述氨基酸序列组成。3.一种编码权利要求2所述纳米抗体序列的核酸，其特征在于，所述编码序列由SEQ ID NO.5所示。4.一种含有权利要求3所述的核酸的表达载体，其特征在于，所述表达载体为pMES4。5.一种含有权利要求4所述表达载体的宿主细胞，其特征在于，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋海鹏，刘原源，于建立，蒋立仲，王准，曹慧，古一，李飞，张霞，
申请(专利权)人：深圳市国创纳米抗体技术有限公司，
类型：发明
国别省市：