针对TFPI的单克隆抗体制造技术

本发明专利技术涉及医药生物领域。具体而言，本发明专利技术公开了一种针对组织因子途径抑制剂(TFPI)的单克隆抗体或其抗原结合片段，以及其医药用途。途。

【技术实现步骤摘要】
针对TFPI的单克隆抗体


[0001]本专利技术涉及医药生物领域。具体而言，本专利技术公开了一种针对组织因子途径抑制剂(TFPI)的单克隆抗体或其抗原结合片段，以及其医药用途。
[0002]专利技术背景
[0003]血液凝固是血液形成稳定的凝块以使出血停止的过程。该过程涉及血液中循环的许多酶原和辅因子原(或“凝固因子”)。那些酶原和辅因子原经由序贯或同时将它们转化成活化形式的数种途径而相互作用。最后，所述过程导致在存在因子Va、离子钙、和血小板的情况下由激活的因子X(FXa)将凝血酶原激活为凝血酶。激活的凝血酶继而诱导血小板聚集，而且将血纤蛋白原转化成血纤蛋白，其然后被激活的因子XIII(FXIIIa)交联以形成凝块。
[0004]可以通过两种独特的途径来实现因子X激活：接触激活途径(以前称为内源性途径)和组织因子途径(以前称为外源性途径)。现在知道用于启动血液凝固的主要途径是组织因子途径。
[0005]因子X可以被与激活的因子VII(FVIIa)联合的组织因子(TF)激活。FVIIa和其必需的辅因子TF的复合物是凝固级联的有力引发剂。
[0006]凝固的组织因子途径受组织因子途径抑制剂(“TFPI”)的负控制。TFPI是FVIIa/TF复合物的一种天然的、FXa依赖性反馈抑制剂。它是多价Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制物的成员。在生理学上，TFPI结合激活的因子X(FXa)以形成异二聚体复合物，其随后与FVIIa/TF复合物相互作用以抑制其活性，因此关闭凝固的组织因子途径。原则上，阻断TFPI活性可以恢复FXa和FVIIa/TF活性，因此延长组织因子途径作用的持续时间，而且放大FXa的生成。血友病A和B均缺乏FXa。
[0007]本领域仍然需要能够阻断TFPI活性的药剂例如TFPI特异性的抗体来治疗凝血相关疾病。
[0008]附图简述
[0009]图1示出人源化轻链与鼠源轻链(A)，人源化重链变体与鼠源重链(B)的氨基酸序列比对结果。
[0010]图2示出人源化h7G6抗体对hTFPI的亲和力。
[0011]图3示出人源化h7G6抗体对FXa-TFPI相互作用的阻断效果。
具体实施方式
[0012]一、定义
[0013]在本专利技术中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本专利技术，下面提供相关术语的定义和解释。
[0014]如本文所用，术语“组织因子途径抑制剂”或“TFPI”指由细胞天然表达的人TFPI的
任何变体、同种型和物种同系物。示例性的人TFPI包含SEQ ID NO:28所示氨基酸序列。
[0015]如本文所用，“抗体”指免疫球蛋白和免疫球蛋白片段，无论天然的或者部分或全部合成(例如重组)产生的，包括其至少包含免疫球蛋白分子的部分可变区的保留全长免疫球蛋白的结合特异性能力的任何片段。因此，抗体包括具有与免疫球蛋白抗原结合结构域(抗体结合位点)同源或基本上同源的结合结构域的任何蛋白。抗体包括抗体片段，例如抗肿瘤细胞抗体片段。如本文所用，因此术语抗体包括合成抗体、重组产生的抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、人抗体、非人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、胞内抗体以及抗体片段，例如但不限于Fab片段、Fab'片段、F(ab
’
)2片段、Fv片段、二硫键连接的Fv(dsFv)、Fd片段、Fd
’
片段、单链Fv(scFv)、单链Fab(scFab)、双抗体、抗独特型(抗Id)抗体、或者上述任何抗体的抗原结合片段。本文所提供的抗体包括任何免疫球蛋白类型(例如，IgG、IgM、IgD、IgE、IgA和IgY)、任何类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类(例如，IgG2a和IgG2b)的成员。
[0016]如本文所用，抗体的“抗体片段”或“抗原结合片段”指全长抗体的任何部分，其少于全长，但是至少包含结合抗原的所述抗体的部分可变区(例如一个或多个CDR和/或一个或多个抗原结合位点)，并且因此保留结合特异性以及所述全长抗体的至少部分特异性结合能力。因此，抗原结合片段指包含与衍生抗体片段的抗体结合相同抗原的抗原结合部分的抗体片段。抗体片段包括通过酶促处理全长抗体所产生的抗体衍生物，以及合成产生的衍生物，例如重组产生的衍生物。抗体包括抗体片段。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab
’
)2、单链Fv(scFv)、Fv、dsFv、双抗体、Fd和Fd
’
片段以及其他片段，包括修饰的片段(参见，例如，Methods in Molecular Biology,Vol 207:Recombinant Antibodies for Cancer Therapy Methods and Protocols(2003)；Chapter 1；p 3-25,Kipriyanov)。所述片段可以包括连接在一起的多条链，例如通过二硫键和/或通过肽接头。抗体片段一般包含至少或约50个氨基酸，并且典型至少或约200个氨基酸。抗原结合片段包括任何抗体片段，其在被插入抗体框架(例如通过置换相应区域)时获得免疫特异性地结合(即表现出至少或至少约10
7-108M-1
的Ka)抗原的抗体。
[0017]如本文所用，“单克隆抗体”指相同抗体的群体，表示单克隆抗体群体中的每个单独的抗体分子与其他抗体分子相同。这种特性与抗体的多克隆群体的特性相反，所述抗体的多克隆群体包含具有多种不同序列的抗体。单克隆抗体可以通过许多公知的方法来制备(Smith et al.(2004)J.Clin.Pathol.57,912-917；和Nelson et al.,J Clin Pathol(2000),53,111-117)。例如，单克隆抗体可以通过永生化B细胞来制备，例如通过与骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤细胞系或者通过用诸如EBV的病毒感染B细胞。重组技术还可以用来在体外通过用携带编码抗体的核苷酸的人工序列的质粒转化宿主细胞来从宿主细胞的克隆群体制备抗体。
[0018]如本文中所用，术语“杂交瘤”或“杂交瘤细胞”指由融合产抗体的淋巴细胞和不产抗体的癌细胞而产生的细胞或细胞系(通常为骨髓瘤或淋巴瘤细胞)。如本领域普通技术人员所知的，杂交瘤可增殖并持续供应产生特定单克隆抗体。用于产生杂交瘤的方法为本领域已知的(见例如，Harlow&Lane，1988)。当提及术语“杂交瘤”或“杂交瘤细胞”时，其还包括杂交瘤的亚克隆和后代细胞。
[0019]如本文所用，“常规抗体”指包含两条重链(其可以标示为H和H
’
)和两条轻链(其可
以标示为L和L
’
)和两个抗原结合位点的抗体，其中每条重链可以是全长免疫球蛋白本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种针对TFPI的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述单克隆抗体包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包含：VL CDR1，其包含SEQ ID NO:12所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:12具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列，VL CDR2，其包含SEQ ID NO:13所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:13具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列，和VL CDR3，其包含SEQ ID NO:14所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:14具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列；所述重链可变区包含：VH CDR1，其包含SEQ ID NO:7所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:7具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列，VH CDR2，其包含SEQ ID NO:8所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:8具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列，和VH CDR3，其包含SEQ ID NO:9所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:9具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列。2.权利要求1的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变区包含：VL CDR1，其包含SEQ ID NO:12所示氨基酸序列，VL CDR2，其包含SEQ ID NO:13所示氨基酸序列，和VL CDR3，其包含SEQ ID NO:14所示氨基酸序列；所述重链可变区包含：VH CDR1，其包含SEQ ID NO:7所示氨基酸序列，VH CDR2，其包含SEQ ID NO:8所示氨基酸序列，和VH CDR3，其包含SEQ ID NO:9所示氨基酸序列。3.权利要求1或2的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述单克隆抗体是人源化抗体。4.权利要求1-3中任一项的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:11所示氨基酸序列或与SEQ ID NO:11具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更高序列相同性的氨基酸序列。5.权利要求1-4中任一项的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述重链可变区包含SEQ ID NO:6所示氨基酸序列或与SEQ ID NO:9具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更高序列相同性的氨基酸序列。6.权利要求1-5中任一项的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述重链可变区包含SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16所示氨基酸序列。7.权利要求1-6中任一项的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述轻链可变区包含选自SEQ ID NO:17-19所示的氨基酸序列。8.权利要求3的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述重链可变区包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列，且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:17所示氨基酸序列。
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【专利技术属性】
技术研发人员：徐霆，汪皛皛，范英，董艳荣，陈丽萍，季建云，
申请(专利权)人：苏州康宁杰瑞生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：