抗菌肽GS18及其用途制造技术

本发明专利技术公开了一种抗菌肽，名为GS18，其序列为GLLRRLRKKIGEIFKKLS，SEQ ID NO:1。所述抗菌肽为人工设计合成的活性多肽，GS18包含18个氨基酸残基，分子量为2155.74Da，等电点为11.74，净电荷为+6。所述的抗菌肽的用途，用于制备治疗革兰氏阴性菌感染的抗菌药物。本发明专利技术的抗菌肽GS18为α螺旋阳离子多肽，具有肽链长度较短、稳定性较好、人工合成方便、净电荷高、杀菌作用强等优点。杀菌作用强等优点。

【技术实现步骤摘要】
抗菌肽GS18及其用途


[0001]本专利技术属于多肽领域，特别是涉及抗菌肽GS18及其应用。

技术介绍

[0002]抗菌肽是广泛存在于以自然界生物体中的一种多肽类物质，其来源十分广泛，目前已在植物、昆虫、两栖类动物、哺乳动物、海洋生物、细菌、病毒等生物体中发现了1700多种抗菌肽。抗菌肽是重要的先天免疫分子，具有广谱抗菌活性、破膜杀菌机制以及不易产生耐药性等特点。同时，抗菌肽被认为是最具潜力的抗生素替代品，所以抗菌肽的研发将成为寻找抗生素替代品的重要突破口，并且抗菌肽在治疗仔猪腹泻方面的研究为抗菌肽在实际应用上提供了重要的参考价值。抗菌肽在抗菌活性方面有进一步改进的空间，同时其产生的细胞毒性也限制了其应用，因此这两方面也是抗菌肽研究的热点，而抗菌肽分子改良是该研究热点较为常用的手段。

技术实现思路

[0003]为了克服现有技术的不足，本专利技术要解决的技术问题是提供一种抗菌肽GS18及其用途。
[0004]一种抗菌肽，名为GS18，其序列为GLLRRLRKKIGEIFKKLS，如SEQ ID NO:1所示。
[0005]所述抗菌肽为人工设计合成的活性多肽，GS18包含18个氨基酸残基，分子量为2155.7Da，等电点为11.74，净电荷为+6。所述的抗菌肽的用途，用于制备治疗革兰氏阴性菌感染的抗菌药物。
[0006]本专利技术的有益效果：
[0007]GS18含有7个正电荷氨基酸，7个疏水氨基酸，在CAMP数据库中拟合显示其具有α螺旋结构，GRAVY值为
‑<br/>0.400，高阳离子性低疏水性使其对革兰氏阴性菌具有较好的靶向性。GS18在大肠杆菌体内的半衰期大于10小时。GS18可特异性与革兰氏阴性菌结合，破坏细胞外膜，抵达内膜发挥杀菌作用。本专利技术的抗菌肽GS18具有肽链长度较短和毒性低等特点。
具体实施方式
[0008]实施例1微量肉汤稀释法药敏实验
[0009]准备无菌的96孔细菌培养板，用微量移液枪吸取50LMHB液体培养基到第2～12排孔，第一排孔内加入100L适当浓度(如256μg/mL)的药物母液，使用移液器从第一排吸取50L药物溶液依次往后梯度稀释，使2排
‑
10排孔内的药物浓度分别为128、64、32、16、8、4、2、1、0.5g/mL。然后由低浓度往高浓度依次将50L稀释好的待测菌液(终浓度5
×
105CFU/mL)加入2～11排溶液中，其中11排为菌液生长对照，12排为空白肉汤对照。操作结束后盖上96孔板的盖子，轻缓地水平摇晃均匀，放置37℃恒温箱过夜培养16
‑
20h，次日观察MIC结果。
[0010]表1 抗菌肽GS18对四种细菌的MIC值
[0011]细菌沙门氏菌大肠杆菌金黄色葡萄球菌肺炎克雷伯菌
MIC(μg/mL)2.449.7719.5378.12
[0012]溶血性实验
[0013]1、实验前准备：
[0014](1)血液的提取：摘眼球取血法从大鼠取1mL血液加入含有1mg肝素钠的4mL EP管中，充分摇匀，防止凝血，然后分装至1.5mL EP管中；
[0015](2)配制药品储备液：称取3.2mg于4mL EP管中，加入3mL生理盐水充分溶解后，转移至15mL EP管中，补加9.5mL生理盐水混匀，得到256μg/mL的抗菌肽储备液。
[0016]2、实验步骤：
[0017](1)将所得血液以1000r/min转速离心5min，弃去上清液，分离得红细胞。用生理盐水洗涤2次，重复离心操作，弃去上清液，得到压积红细胞。
[0018](2)取2滴压积红细胞加入4mL生理盐水即得2％(体积分数)红细胞悬液A，再取2滴压积红细胞加入4mL蒸馏水水即得2％(体积分数)红细胞悬液B；
[0019](3)对96孔板进行加样(如表2
‑
1所示)，先在2
‑
11号孔加入50μL生理盐水，使用系列稀释的方法，1号孔加入抗菌肽溶液后吸取50μL到2号孔混匀，并以此类推。直至9号孔混匀后吸出50μL弃去。10号、11号孔中不含抗菌肽，
[0020]表2
‑
1 溶血性实验微孔板加样表
[0021][0022]注：抗菌肽溶液的初浓度为256μg/ml，红细细悬液A为含2％红细胞的生理盐水，红细胞悬液B为含2％红细胞的蒸馏水
[0023]10孔为阴性对照，11孔为阳性对照
[0024]其中10号孔为不溶血的阴性对照，11号孔为完全溶血的阳性对照。再依次在1
‑
10号孔中加入50μL红细胞悬液A，在11号孔中加入50μL红细胞悬液B；
[0025](4)加样完毕后，于37℃下摇床震荡4h；
[0026](5)时间到后待红细胞沉淀，吸取40uL上清液加入到另一个干净的96孔板中，采用酶标仪在540nm波长下测定吸光度。
[0027][0028]3、实验结果
[0029]表2
‑
2 溶血性实验结果
[0030][0031]注：此实验吸光度是在波长为540nm条件下测得的各浓度抗菌肽引起溶血率均低
于1％，可认为溶血毒性很小，安全性较好。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗菌肽，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所述。2.如...

【专利技术属性】
技术研发人员：薛建鹏，徐寒梅，马旭普，王鹏飞，谢廷智，张恩铭，梁煜彬，王冉，孙利厂，王瑱，杜南星，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：