一种双菌生物催化剂及在合成西他列汀中的应用制造技术

本发明专利技术涉及生物制药技术领域，尤其是一种双菌生物催化剂及在合成西他列汀中的应用，该双菌生物催化剂由枯草芽孢杆菌全细胞催化剂和巨大芽孢杆菌全细胞催化剂组成，二者的质量比为1:0.1～1，所述枯草芽孢杆菌全细胞催化剂由含有如SEQ ID NO：1所示外源基因的重组枯草芽孢杆菌的工程菌制得。用于合成西他列汀时，由化合物II作为起始原料，在缓冲液、助溶剂、辅酶PLP、氨基供体的存在下，经双菌生物催化剂催化转化为西他列汀，其反应路线为，其反应路线为，其反应路线为，其反应路线为，

【技术实现步骤摘要】
一种双菌生物催化剂及在合成西他列汀中的应用


[0001]本专利技术涉及生物制药
，具体领域为一种生物催化剂及西他列汀的生物合成方法。

技术介绍

[0002]西他列汀(Sitagliptin)的化学名为(3R)
‑3‑
氨基
‑
[3
‑
(三氟甲基)
‑
5,6,7,8
‑
四氢
‑
1,2,4
‑
三唑并 [4,3
‑
a]吡嗪
‑7‑
基]‑4‑
(2,4,5
‑
三氟苯基)丁
‑1‑
酮(结构式如下所示)。
[0003][0004]磷酸西他列汀(sitagliptin phosphate)是一种新型抗II型糖尿病药物，服用方式为口服，毎次一片，一次约100mg剂量，在2006年10月由默沙东公司成功研制并开发，经美国 FDA批准上市，是史上第一个用于治疗II型糖尿病的二肽基肽酶IV(DPP
‑
4)抑制剂类药物。
[00本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种双菌生物催化剂，其特征在于：由枯草芽孢杆菌全细胞催化剂和巨大芽孢杆菌全细胞催化剂组成，二者的质量比为1:0.1～1，所述枯草芽孢杆菌全细胞催化剂由含有如SEQ ID NO：1所示外源基因的重组枯草芽孢杆菌的工程菌制得。2.根据权利要求1所述的双菌生物催化剂，其特征在于：枯草芽孢杆菌的菌株为Bacillus subtili168，表达质粒为pHT43或pHT01。3.根据权利要求1所述的双菌生物催化剂，其特征在于：巨大芽孢杆菌的菌株为Bacillus megateriumATCC14581模式菌株。4.根据权利要求1所述的双菌生物催化剂，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌全细胞催化剂的制备方法具体为：(1)将如SEQ ID NO：1所示的生物酶基因进行全合成后，设计上下游引物F、R，如SEQ ID NO：2
‑
3所示，进行PCR扩增，PCR条件为：98℃3min，95℃30s，55℃90s，72℃90s，35个循环；PCR扩增体系：模板1.5μL，上下游引物各1.5μL，灭菌的双蒸水20.5μL，PrimerSTAR Mix 25μL；(2)采用胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度；BamHI和ZraI酶切胶回收产物及pHT01质粒，胶回收试剂盒对酶切后的胶回收产物进行纯化和回收，胶回收试剂盒对酶切后质粒进行纯化回收，电泳检验回收产物的浓度；目的基因与载体pHT01连接，连接体系：目的基因4μL，载体pHT01 2μL，Buffer 2μL，连接酶1μL，16℃过夜连接；将构建好的载体通过转化技术导入Bacillus subtilis168中，涂布在含的LB抗性平板中，放入37℃培养箱中过夜，将长出来的单菌落进行质粒提取和测序，最终获得含生物酶基因的重组工程菌Recombinant
‑
01；(3)将表达生物酶的Recombinant
‑
01，接种至LB液体培养基中，接种量为培养基体积的1％，37℃的条件下，220rpm摇床中过夜培养后，作为种子液；将新鲜的种子液接入TB培养基中发酵培养，37℃的条件下，220rpm摇床中培养至OD
600
在0.6～0.8时向培...

【专利技术属性】
技术研发人员：石利平，陈本顺，何伟，叶金星，徐春涛，程瑞华，张维冰，张凌怡，杨武林，尹斌，江涛，卞佳，
申请(专利权)人：江苏阿尔法药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：