一种双菌生物催化剂及在合成西他列汀中的应用制造技术

本发明专利技术涉及生物制药技术领域，尤其是一种双菌生物催化剂及在合成西他列汀中的应用，该双菌生物催化剂由枯草芽孢杆菌全细胞催化剂和巨大芽孢杆菌全细胞催化剂组成，二者的质量比为1:0.1～1，所述枯草芽孢杆菌全细胞催化剂由含有如SEQ ID NO：1所示外源基因的重组枯草芽孢杆菌的工程菌制得。用于合成西他列汀时，由化合物II作为起始原料，在缓冲液、助溶剂、辅酶PLP、氨基供体的存在下，经双菌生物催化剂催化转化为西他列汀，其反应路线为，其反应路线为，其反应路线为，其反应路线为，

【技术实现步骤摘要】
一种双菌生物催化剂及在合成西他列汀中的应用


[0001]本专利技术涉及生物制药
，具体领域为一种生物催化剂及西他列汀的生物合成方法。

技术介绍

[0002]西他列汀(Sitagliptin)的化学名为(3R)
‑3‑
氨基
‑
[3
‑
(三氟甲基)
‑
5,6,7,8
‑
四氢
‑
1,2,4
‑
三唑并 [4,3
‑
a]吡嗪
‑7‑
基]‑4‑
(2,4,5
‑
三氟苯基)丁
‑1‑
酮(结构式如下所示)。
[0003][0004]磷酸西他列汀(sitagliptin phosphate)是一种新型抗II型糖尿病药物，服用方式为口服，毎次一片，一次约100mg剂量，在2006年10月由默沙东公司成功研制并开发，经美国 FDA批准上市，是史上第一个用于治疗II型糖尿病的二肽基肽酶IV(DPP
‑
4)抑制剂类药物。
[0005]西他列汀的化学制备法与生物制备法均有报道，其中以ATA177转氨酶用于制备西他列汀最为广泛，国内外多所企业、高校对ATA117转氨酶的优化进行了研究。如 CN103608355A中，默沙东公司通过树脂固载ATA117，对转氨酶ATA117多次套用，降低了其生产成本。CN109777813A中，浙江工业大学通过将转氨酶
‑
PLP共固定化，进行西塔列汀的制备，该方法稳定性好，固载酶使用寿命长，有机溶剂耐受性好，可多次重复利用。
[0006]转氨酶催化反应是制备西他列汀的最后一步反应，大肠表达系统制备转氨酶通常需要添加细菌内毒素的去除步骤，使用常规枯草芽孢表达系统，虽然无细菌内毒素产生，但表达量过低，生产应用价值偏低。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于提供一种双菌生物催化剂及在合成西他列汀中的应用。
[0008]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0009]一种双菌生物催化剂，由枯草芽孢杆菌全细胞催化剂和巨大芽孢杆菌全细胞催化剂组成，二者的质量比为1:0.1～1，所述枯草芽孢杆菌全细胞催化剂由含有如SEQ ID NO：1所示外源基因的重组枯草芽孢杆菌的工程菌制得。
[0010]其中，枯草芽孢杆菌的菌株为Bacillus subtili168，表达质粒为pHT43或pHT01。
[0011]其中，巨大芽孢杆菌的菌株为Bacillus megateriumATCC14581模式菌株(ATCC菌种库)。
[0012]其中，所述枯草芽孢杆菌全细胞催化剂的制备方法具体为：
[0013](1)将如SEQ ID NO：1所示的生物酶基因进行全合成后，设计上下游引物F、R，如SEQ ID NO：2
‑
3所示，进行PCR扩增，PCR条件为：98℃3min，95℃30s，55℃90 s，72℃90s，35个循环；PCR扩增体系：模板1.5μL，上下游引物各1.5μL，灭菌的双蒸水20.5μL，PrimerSTAR Mix25μL；
[0014](2)采用胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度； BamHI和ZraI酶切胶回收产物及pHT01质粒，胶回收试剂盒对酶切后的胶回收产物进行纯化和回收，胶回收试剂盒对酶切后质粒进行纯化回收，电泳检验回收产物的浓度；目的基因与载体pHT01连接，连接体系：目的基因4μL，载体pHT01 2μL，Buffer 2μL，连接酶1μL，16℃过夜连接；将构建好的载体通过转化技术导入Bacillus subtilis168中，涂布在含的LB抗性平板中，放入37℃培养箱中过夜，将长出来的单菌落进行质粒提取和测序，最终获得含生物酶基因的重组工程菌Recombinant
‑
01；
[0015](3)将表达生物酶的Recombinant
‑
01，接种至LB液体培养基中，接种量为培养基体积的1％，37℃的条件下，220rpm摇床中过夜培养后，作为种子液；将新鲜的种子液接入TB培养基中发酵培养，37℃的条件下，220rpm摇床中培养至OD
600
在0.6～0.8时向培养基中加入IPTG，IPTG的浓度为0.5mM，再于18℃诱导22h；发酵液诱导结束后，于4℃， 12000rpm离心5min，收集菌体；用pH7.0，0.1M的PBS缓冲液洗涤后，获得枯草芽孢杆菌全细胞催化剂。
[0016]其中，所述巨大芽孢杆菌全细胞催化剂的制备方法具体为：将BacillusmegateriumATCC14581模式菌株接种至LB液体培养基中，接种量为培养基体积的1％， 37℃的条件下，220rpm摇床中过夜培养后，收集菌体；用pH7.0，0.1M的PBS缓冲液洗涤后，获得巨大芽孢杆菌全细胞催化剂。
[0017]本专利技术所述的双菌生物催化剂在合成西他列汀中的应用，具体为：
[0018]由化合物II作为起始原料，在缓冲液、助溶剂、辅酶PLP(磷酸吡哆醛)、氨基供体的存在下，经双菌生物催化剂催化转化为化合物I，其反应路线为，
[0019][0020]其中，所述化合物II和双菌生物催化剂中的枯草芽孢杆菌全细胞催化剂的质量比为 1:1～30，优选为1:10～20。
[0021]其中，所述氨基供体选自丙氨酸、三乙醇胺、异丙胺、丙胺、乙胺、色氨酸、丁胺或α
‑
氨基戊二酸中的一种或几种；优选为异丙胺或丙氨酸。
[0022]其中，所述化合物II与所述氨基供体的质量比为1:1～10；优选为1:1～5。
[0023]其中，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液；优选的，所述缓冲液为0.1～2M、pH值为8.0～8.5 的三乙醇胺盐酸盐缓冲液。
[0024]所述助溶剂选自甲醇、乙醇、乙酸丁酯、DMSO中的任意一种，优选为DMSO；
[0025]所述助溶剂与缓冲液的体积比为1:1～100，优选为1:10；
[0026]双菌生物催化剂中的枯草芽孢杆菌全细胞催化剂与辅酶PLP的质量比5～30:1；
[0027]催化反应时，反应温度为0～60℃；优选为30～45℃。
[0028]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
[0029]本专利技术提供了一种全新的双菌生物催化剂及在合成西他列汀中的酶催化制备工艺，该方法一定程度上解决了现有技术中枯草芽孢杆菌作为全细胞相对于大肠杆菌反应体系反应率不高的问题，且枯草芽孢杆菌无细菌内毒素的生成，安全无污染。
[0030]本专利技术通过枯草芽孢杆菌全细胞催化剂与巨型芽孢杆菌全细胞催化剂协同催化，避免了添加甘油等添加剂导致的酶催化废水初始COD大幅度增加等问题。本专利技术方法，对环境友好、无污染，具有广阔的应用前景。
附图说明
[0031]图1为实施例1的载体构建示意图；
[0032]图2为西本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种双菌生物催化剂，其特征在于：由枯草芽孢杆菌全细胞催化剂和巨大芽孢杆菌全细胞催化剂组成，二者的质量比为1:0.1～1，所述枯草芽孢杆菌全细胞催化剂由含有如SEQ ID NO：1所示外源基因的重组枯草芽孢杆菌的工程菌制得。2.根据权利要求1所述的双菌生物催化剂，其特征在于：枯草芽孢杆菌的菌株为Bacillus subtili168，表达质粒为pHT43或pHT01。3.根据权利要求1所述的双菌生物催化剂，其特征在于：巨大芽孢杆菌的菌株为Bacillus megateriumATCC14581模式菌株。4.根据权利要求1所述的双菌生物催化剂，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌全细胞催化剂的制备方法具体为：(1)将如SEQ ID NO：1所示的生物酶基因进行全合成后，设计上下游引物F、R，如SEQ ID NO：2
‑
3所示，进行PCR扩增，PCR条件为：98℃3min，95℃30s，55℃90s，72℃90s，35个循环；PCR扩增体系：模板1.5μL，上下游引物各1.5μL，灭菌的双蒸水20.5μL，PrimerSTAR Mix 25μL；(2)采用胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度；BamHI和ZraI酶切胶回收产物及pHT01质粒，胶回收试剂盒对酶切后的胶回收产物进行纯化和回收，胶回收试剂盒对酶切后质粒进行纯化回收，电泳检验回收产物的浓度；目的基因与载体pHT01连接，连接体系：目的基因4μL，载体pHT01 2μL，Buffer 2μL，连接酶1μL，16℃过夜连接；将构建好的载体通过转化技术导入Bacillus subtilis168中，涂布在含的LB抗性平板中，放入37℃培养箱中过夜，将长出来的单菌落进行质粒提取和测序，最终获得含生物酶基因的重组工程菌Recombinant
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01；(3)将表达生物酶的Recombinant
‑
01，接种至LB液体培养基中，接种量为培养基体积的1％，37℃的条件下，220rpm摇床中过夜培养后，作为种子液；将新鲜的种子液接入TB培养基中发酵培养，37℃的条件下，220rpm摇床中培养至OD
600
在0.6～0.8时向培...

【专利技术属性】
技术研发人员：石利平，陈本顺，何伟，叶金星，徐春涛，程瑞华，张维冰，张凌怡，杨武林，尹斌，江涛，卞佳，
申请(专利权)人：江苏阿尔法药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：