一种突变型waxy基因及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种突变型waxy基因及其应用，具体地涉及一种突变型的waxy基因，所述的突变型waxy基因与亲本waxy基因相比，在对应于SEQ ID NO.:1的第435位核苷酸发生突变。waxy基因突变后的植物直链淀粉含量降低，在改善稻米的食用品质方面具有非常广阔的应用前景。米的食用品质方面具有非常广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种突变型waxy基因及其应用


[0001]本专利技术属于生物技术、作物遗传育种领域，具体涉及一种突变型waxy基因及其应用，尤其涉及一种突变型waxy基因及其在降低植物中直链淀粉含量的方法与应用。

技术介绍

[0002]稻米(Oryza sativa)被世界人口的2/3所食用，是至少其中一半人口饮食中的主要能量来源。大米是一种低成本食品，制备简便，快速，并且可以与各种菜肴搭配食用。
[0003]水稻主要由碳水化合物组成，在胚乳中主要以淀粉(90％)的形式存在。淀粉广泛用于食品，造纸和化学工业。淀粉根据结构不同，可以分为直链淀粉和支链淀粉。在水稻中，Waxy(Wx)基因编码颗粒结合淀粉合成酶(GBSS1)，该基因可以控制胚乳中的直链淀粉合成，Waxy位点内的自然等位基因变异是影响大米中的直链淀粉含量(AC)的主要原因。直链淀粉含量(Amylose content， AC)为直链淀粉占精米粉干重的百分比，是决定稻米蒸煮与食味品质的关键因素之一。根据其含量高低，可将稻米直链淀粉含量分为极低(2％～9％)、低(10 ％～20％)、中(20％～25％)和高(＞25％)四类，糯稻直链淀粉含量一般低于2 ％。稻米胚乳中直链淀粉含量能影响蒸煮后米饭柔软性，直链淀粉含量过低，膨胀性小，米饭粘；直链淀粉含量过高，膨胀性大，变冷后质地较硬；中等直链淀粉含量的稻米煮后比较松软，蒸煮品质相对好。不同品种的稻米中直链淀粉和支链淀粉的比例存在很大差异。
[0004]CRISPR/Cas基因编辑技术是近几年新兴的基因工程技术，其是由 guideRNA介导的DNA切割技术，针对Cas的不同已经开发出多种编辑系统。基因组编辑及商户可以定向修饰基因组，加速了育种进程，是实验精准育种的重要技术突破。
[0005]CRISPR/Cas编辑技术可以实现4种定点编辑：第一种是基因的定点敲除， Cas蛋白在靶向RNA(gRNA)的指导下识别和切割靶点，产生双链DNA断裂；断裂的DNA通常以非同源末端连接(NHEJ)来修复；在修复时容易产生移码突变以破坏这个基因。第二种是对靶标进行同源置换来更换靶标序列或者定点插入。在产生双链DNA断裂时，如果在附近存在同源修复模板，这时可能发生同源置换或定点插入。同源置换的效率较低，并随着要置换的序列的长度增长而变得更低。第三种是单碱基编辑。单碱基编辑是利用CRISPR/Cas系统将脱氨酶靶向基因组中特定的位点从而对特定碱基进行修饰的基因编辑方法。此种方法已经在水稻中成功运用。第四种是基因组引导编辑技术。引导编辑是将逆转录酶与cas9切口酶结合，在单链引导RNA引导下，按转录模板进行点突变、插入或缺失突变的编辑方法。
[0006]因此，本领域急需运用基因编辑技术，突变waxy基因，降低直链淀粉含量，改善稻米的食用品质。

技术实现思路

[0007]本专利技术目的是提供一种可降低植物中直链淀粉含量的突变型waxy基因及其应用。
[0008]一方面，本专利技术提供了一种突变型waxy基因，所述突变基因与野生型基因序列相比，在对应于SEQ ID NO.:1所示核苷酸序列的第435位核苷酸处发生突变。
[0009]在一个实施方式中，所述亲本waxy基因第435位核苷酸为胞嘧啶(C)
[0010]在一个实施方式中，所述第435位核苷酸为胞嘧啶(C)，突变为非胞嘧啶(C)，所述非胞嘧啶(C)的核苷酸选自下组的一种或多种核苷酸：腺嘌呤 (A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)。
[0011]在优选的实施方式中，所述第435位的胞嘧啶(C)突变为胸腺嘧啶(T)。
[0012]在一个实施方式中，所述亲本waxy基因可以来源于任何植物。
[0013]在一个实施方式中，所述亲本waxy基因来源于选自下组的一种或多种植物：禾本科、豆科、藜科、十字花科植物。
[0014]在一个实施方式中，所述亲本waxy基因来源于选自下组的一种或多种植物：拟南芥、水稻、烟草、玉米、高粱、大麦、小麦、小米、大豆、番茄、马铃薯、藜麦、生菜、油菜、白菜、草莓。
[0015]在一个优选实施方式中，本专利技术的亲本waxy基因来源于稻属，特别是水稻。
[0016]在一个实施方式中，所述亲本waxy基因能编码具有活性的蛋白、并且所述亲本waxy基因的核苷酸序列与SEQ ID NO.:1所示的核苷酸序列具有至少80 ％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的序列同一性。
[0017]在优选的实施方式中，所述亲本waxy基因具有SEQ ID NO.:1所示的序列，或者，所述亲本waxy基因核苷酸序列如SEQ ID NO.:1所示。
[0018]在一个实施方式中，所述的突变waxy基因与SEQ ID NO.:2所示序列的同源性至少为60％，较佳地至少为70％，更佳地至少为80％，最佳地至少为90％，如95％、97％、99％。
[0019]在一个实施方式中，所述的突变waxy基因具有SEQ ID NO.:2所示核苷酸序列。
[0020]在一个实施方式中，所述的突变waxy基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.:2 所示。
[0021]另一方面，本专利技术还提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸序列为上述突变型waxy基因的多核苷酸。
[0022]在一个实施方式中，上述多核苷酸还包括与上述多核苷酸互补的多核苷酸。
[0023]在一个实施方式中，所述的多核苷酸选自下组：基因组序列、cDNA序列、 RNA序列、或其组合。
[0024]在一个实施方式中，所述的多核苷酸优选是单链的或双链的。
[0025]在一个实施方式中，所述的多核苷酸在所述突变基因的ORF的侧翼还额外含有选自下组的辅助元件：信号肽、分泌肽、标签序列(如6His)、或其组合。
[0026]在一个实施方式中，该多核苷酸还包含与所述突变型waxy基因的ORF序列操作性连接的启动子。
[0027]在一个实施方式中，所述的启动子选自下组：组成型启动子、组织特异性启动子、诱导型启动子、或者强启动子。
[0028]另一方面，本专利技术还提供了一种载体。
[0029]在一个实施方式中，所述载体包含上述突变型waxy基因，优选的，所述载体还包括与上述核酸序列可操作连接的表达调控元件。
[0030]在一个实施方式中，所述的载体包括表达载体、穿梭载体、整合载体。
[0031]在一个实施方式中，载体也可以是对宿主细胞内源性的waxy基因进行基因编辑的载体。
[0032]在一个实施方式中，所述表达载体中还至少含有一个复制起点，以实现自我复制。
[0033]在一个实施方式中，所述载体可以是当引入宿主细胞时被整合入基因组中并与其所整合入的染色体一起复制的载体。
[0034]在一个实施方式中，载体可以是质粒、病毒、粘粒、噬菌体等类型，它们是本领域技术人员所熟知的。
[0035]优选地，本专利技术中的表达载体是质粒。...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种突变型waxy基因，所述突变基因与亲本基因的核苷酸序列相比，在对应于SEQ ID NO.:1所示序列的第435位核苷酸处发生突变。2.根据权利要求1所述的突变型waxy基因，其特征在于，所述第435位核苷酸由胞嘧啶(C)突变为胸腺嘧啶(T)。3.根据权利要求1或2所述的突变型waxy基因，其特征在于，所述亲本waxy基因来源于单子叶植物或双子叶植物；优选地，所述亲本waxy基因来源于水稻。4.一种核酸构建体，其特征在于，所述构建体含有权利要求1-3任一所述的突变型waxy基因的多核苷酸，优选的，还含有与之可操作连接的调控元件；优选地，所述调控元件选自下组中的一种或任意几种：增强子、转座子、启动子、终止子、前导序列、多核苷酸序列、标记基因。5.一种载体，其特征在于，所述载体包括权利要求1-3任一所述的突变型waxy基因的多核苷酸，或者，包含权利要求4所述的核酸构建体。6.一种宿...

【专利技术属性】
技术研发人员：张金山，牛小牧，
申请(专利权)人：山东舜丰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：