一种β亚基突变的腈水合酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种β亚基突变的腈水合酶突变体及其应用。一种腈水合酶的β亚基突变体，由野生型β亚基序列经突变所得，野生型β亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，突变位点为L25F、G27Y、N59P和A173N中的至少一个。本发明专利技术通过蛋白质分子改造，显著提高了源于博得特氏菌DSM 12804(Bordetella petrii DSM12804)的腈水合酶在基因工程菌E.coli BL21(DE3)中的稳定性表达。以丙烯腈为底物，本发明专利技术的腈水合酶突变体在45℃下热稳定性显著提高，突变体NHAB

【技术实现步骤摘要】
一种
β
亚基突变的腈水合酶突变体及其应用


[0001]本专利技术涉及生物
，特别是涉及一种β亚基突变的腈水合酶突变体及其应用。

技术介绍

[0002]腈水合酶(Nitrile hydratase，NHase)是一类可催化腈类化合物水合生成酰胺类物质的生物催化剂。微生物生产的腈水合酶可以高效催化丙烯腈水合生成丙烯酰胺；丙烯酰胺聚合生成的聚丙烯酰胺作为降阻剂、絮凝剂和增稠剂在石油开采、水处理以及造纸等方面广泛应用。
[0003]生物酶催化法制备丙烯酰胺相较于传统的化学催化法，具有转化效率高、产物纯度高、反应条件温和以及环境友好等优点，有逐步取代化学法的趋势。日本三菱公司利用含有腈水合酶的玫瑰色红球菌J1(CN91101323.7)催化丙烯腈生产丙烯酰胺，年产量达20万吨以上。但红球菌是一种野生菌，其生长周期较长、生产效率较低，并且仅在10～30℃条件下稳定，因此在实际生产应用中还是有一定限制。目前，生物酶催化法生产丙烯酰胺的研究重点在于高产腈水合酶菌株的发现以及对腈水合酶本身性能的改造提高。在水合反应过程中，游离细胞内的腈水合酶受到流加的丙烯腈和高浓度的丙烯酰胺溶液抑制作用以及不稳的反应温度影响，催化活性迅速下降，因此无法在一批次的水合反应中获得较高的产物浓度。工业化生产中必须进一步通过高温浓缩工序得到高浓度丙烯酰胺，这使得生产成本显著提高。为了解决这一问题，必须显著提高腈水合酶的稳定性，包括热稳定性和丙烯酰胺耐受性。
[0004]通过构建具有腈水合酶催化活性的基因工程菌株，并对腈水合酶进行蛋白质工程改造可在一定程度上解决解决丙烯酰胺生产中的实际问题。基因工程菌适应性强，发酵周期短，有利于实现大规模培养和工业化生产，且可以有效地降低生产成本。专利文献(CN104498466)公开了一种来源于博得特氏菌DSM 12804(Bordetella petrii DSM12804)的腈水合酶(NHAB)基因序列，其对丙烯腈有较高的催化活力，但其热稳定性和产物耐受性仍不能满足工业化要求。因此，选择NHAB进行蛋白质工程改造，可获得热稳定性和产物耐受性均有提高的腈水合酶突变体，更好地应用于丙烯酰胺的大规模生产。

技术实现思路

[0005]本专利技术针对来源于博得特氏菌DSM 12804(Bordetella petrii DSM12804)的腈水合酶，对β亚基进行理性设计，提供了多个热稳定性和产物耐受性显著提高的腈水合酶突变体，这些突变体可以用于生产丙烯酰胺。
[0006]一种腈水合酶的β亚基突变体，由野生型β亚基序列经突变所得，野生型β亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，突变方式为以下一种：
[0007](1)L25F、G27Y、N59P或A173N；
[0008](2)L25F/G27Y、L25F/N59P、L25F/A173N、G27Y/N59P、G27Y/A173N或N59P/A173N；
[0009](3)L25F/G27Y/N59P、L25F/G27Y/A173N、L25F/N59P/A173N或G27Y/N59P/A173N；
[0010](4)L25F/G27Y/N59P/A173N。
[0011]本专利技术又提供了一种β亚基突变的腈水合酶突变体，包括α亚基和β亚基，其中，所述β亚基为所述的β亚基突变体。
[0012]优选的，所述的腈水合酶突变体，α亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0013]本专利技术又提供了一种用于表达所述腈水合酶突变体的基因簇，所述基因簇包括分别编码α亚基、β亚基突变体以及调控蛋白p14K的基因序列。其中，编码α亚基的基因序列如SEQ ID NO.4所示，编码调控蛋白p14K的基因序列如SEQ ID NO.6所示，编码野生型β亚基的基因序列如SEQ ID NO.5所示，编码β亚基突变体的基因序列根据上述编码野生型β亚基的基因序列对突变位点相应的位置进行突变后所得。
[0014]优选的，编码α亚基的基因序列与编码β亚基突变体的基因序列之间具有第一连接序列，第一连接序列的序列为：GGAGATCATC；编码β亚基突变体的基因序列与编码调控蛋白p14K的基因序列之间具有第二连接序列，第二连接序列的序列为：TC。α亚基、β亚基及调控蛋白p14K对应的编码基因均是独立表达的，各自均有起始密码子和终止密码子，而第一连接序列和第二连接序列为非编码序列，属于RBS结合位点。
[0015]本专利技术又提供了包含所述基因簇的重组表达载体。
[0016]本专利技术又提供了包含所述重组表达载体的基因工程菌。
[0017]本专利技术还提供了所述的腈水合酶突变体在催化丙烯腈生产丙烯酰胺中的应用。
[0018]本专利技术还提供了所述的基因工程菌在催化丙烯腈生产丙烯酰胺中的应用。
[0019]与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：通过蛋白质分子改造，显著提高了源于博得特氏菌DSM 12804(Bordetella petrii DSM12804)的腈水合酶在基因工程菌E.coli BL21(DE3)中的稳定性表达。以丙烯腈为底物，本专利技术的腈水合酶突变体在45℃下热稳定性显著提高，突变体NHAB
‑
B4M为NHAB的5.4倍，并且在100g/L丙烯酰胺溶液中的耐受性提高了3.6倍，具有非常大的工业应用前景。
附图说明
[0020]图1为腈水合酶NHAB催化丙烯腈生成丙烯酰胺的液相检测图谱。
[0021]图2为腈水合酶野生型NHAB和突变体的初始相对酶活以及45℃水浴热处理1h后残余酶活的结果图。
[0022]图3为腈水合酶野生型NHAB和最佳突变体NHAB
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B4M在100g/L丙烯酰胺溶液孵育2h后的残余酶活结果图。
具体实施方式
[0023]本专利技术中的实验方法如无特别说明均为常规方法，基因克隆操作具体可参见J.萨姆布鲁克等编的《分子克隆实验指南》。
[0024]本专利技术所涉及带有腈水合酶基因的重组大肠杆菌，所用载体为pET
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30a(+)，所用宿主为大肠杆菌E.coli BL21(DE3)。制备化转感受态细胞的试剂盒购自TAKARA公司。
[0025]下游催化工艺所用试剂：丙烯腈购自国药集团化学试剂有限公司；乙酰胺购自上海麦克林生化科技有限公司；丙烯酰胺购自阿拉丁试剂有限公司；其他常用试剂购自国药
集团化学试剂有限公司。在本申请文本中所使用的氨基酸三字母或单字母表达方式，采用IUPAC规定的氨基酸代码(Eur.J.Biochem.，138：9
‑
37，1984)。
[0026]酶活的定义(U/mL)：每分钟催化底物丙烯腈生成1μmol丙烯酰胺所需的酶量。
[0027]腈水合酶酶活标准检测体系：适量的酶液、0.8M底物，总体系为5mL，反应介质为pH 7.5的0.25M磷酸盐缓冲液。28℃反应5min，液相检测产物丙烯酰胺的生成量。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种腈水合酶的β亚基突变体，其特征在于，由野生型β亚基序列经突变所得，野生型β亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，突变方式为以下一种：(1)L25F、G27Y、N59P或A173N；(2)L25F/G27Y、L25F/N59P、L25F/A173N、G27Y/N59P、G27Y/A173N或N59P/A173N；(3)L25F/G27Y/N59P、L25F/G27Y/A173N、L25F/N59P/A173N或G27Y/N59P/A173N；(4)L25F/G27Y/N59P/A173N。2.一种β亚基突变的腈水合酶突变体，其特征在于，包括α亚基和β亚基，其中，所述β亚基为权利要求1所述的β亚基突变体。3.如权利要求2所述的腈水合酶突变体，其特征在于，α亚基的氨基酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨立荣，许金玲，周海胜，张红玉，吴坚平，
申请(专利权)人：浙江大学杭州国际科创中心，
类型：发明
国别省市：