一株高产多杀菌素的刺糖多孢菌制造技术

本发明专利技术公开了一种高产多杀菌素的刺糖多孢菌，属于微生物技术领域。本发明专利技术高产多杀菌素的刺糖多孢菌为保藏编号为CCTCC NO：M 2021307的刺糖多孢菌(Saccharopolysporaspinosa)WHU1107，该菌株经过诱变后得到，其在装有25mL发酵培养基的培养瓶中经发酵培养后多杀菌素的产量高达4g/L以上，远高于现有已报道菌株，可用于生产多杀菌素。本发明专利技术为多杀菌素的产业化生产提供了新的材料。的产业化生产提供了新的材料。的产业化生产提供了新的材料。

【技术实现步骤摘要】
一株高产多杀菌素的刺糖多孢菌


[0001]本专利技术属于微生物
，具体涉及一株高产多杀菌素的刺糖多孢菌。

技术介绍

[0002]多杀菌素类化合物(spinosyns)是由刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)进行有氧发酵后获得的一种次级代谢产物，是一种新型的绿色广谱生物杀虫剂，属于大环内酯类抗生素。多杀菌素独特的杀虫机理表现出生物农药的安全性和化学农药的快速性，并且由于多杀菌素的易降解性，对环境、农作物和哺乳动物无害，没有致癌、致畸、致突变或神经毒性，因此曾三次获得美国“总统绿色化学品挑战奖”。目前，多杀菌素仍由刺糖多孢菌通过有氧发酵进行生产。尽管有多个专利报道通过改良培养基或发酵罐的控制方法来提升多杀菌素的产量，但由于菌种本身发酵产量不佳，因此通过发酵优化也很难实现规模化生产，因此我国至今尚未实现该品种的产业化。目前，急需产量较高的菌株以促进多杀菌素的推广及应用。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的在于解决现有刺糖多孢菌发酵生产多杀菌素产量低的问题，提供一株高产多杀菌素的刺糖多孢菌。
[0004]本专利技术的目的通过下述技术方案实现：
[0005]一株高产多杀菌素的刺糖多孢菌，其为刺糖多孢菌WHU1107菌株，该菌株已于2021年3月31日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址：中国.武汉.武汉大学)，分类命名为Saccharopolyspora spinosa WHU1107，保藏编号为CCTCC NO：M 2021307。/>[0006]所述的刺糖多孢菌WHU1107菌株发酵生产多杀菌素的产量远高于现有已报道菌株，其可用于生产多杀菌素。
[0007]一种生产多杀菌素的方法，包括以下步骤：将刺糖多孢菌WHU1107菌株接种到发酵培养基中，通过发酵得到含多杀菌素的发酵物。
[0008]进一步地，所述的发酵培养基的配方为：每100mL水中加入8g的葡萄糖、2g的棉籽饼粉、1g的蛋白粉、0.5g的酵母粉、0.4g的柠檬酸三钠、0.2g的磷酸氢二钾、0.3g的碳酸钙、0.2g的硫酸铵、5g的菜籽油，pH 7.0。
[0009]进一步地，所述的发酵的条件为：250rpm、28℃、湿度60％。
[0010]上述多杀菌素包括多杀菌素A(Spinosyns A)和多杀菌素D(Spinosyns D)，其化学式为：
[0011]Spinosad:An Omics
‑
Guided Large Polyketide Synthase Gene Cluster Reconstitution in Streptomyces[J].Acs Synth Biol,2017.)中的检测方法，分析发酵液中是否含有多杀菌素。发现在第1瓶和第7瓶中有多杀菌素产生，将第1瓶和第7瓶的共10株菌按照上述方法进行逐一发酵，最终发现3株可以产生多杀菌素的菌株，其产量分别为51.2mg/L、253mg/L和336mg/L，分别命名为WHU1100、WHU1101和WHU1102。
[0026]2、菌株诱变
[0027]将WHU1102的菌株斜面用生理盐水制备成孢子悬液，脱脂棉过滤后调整孢子浓度为10
‑6～10
‑7个/mL，取单孢子悬液10mL于无菌的直径9cm平皿内，在距15W紫外灯20cm处照射30s，然后按照递减10倍进行逐级稀释涂板。
[0028]将每20株菌分为一组，按照上述方法进行发酵筛选，共筛选约3000株菌，将其中产量最高的1组，共20株选为初步筛选菌株。将这20株菌株进行混合再按照上述方法进行第二轮诱变，同样筛选约3000株，选多杀菌素产量最高的一组20株为待筛选菌株(分别命名为WHU1103
‑
WHU1122)。
[0029]将这20株菌株按照上述方法进行逐一发酵，其中最高产量的菌株为WHU1107，参考文献(Gao
‑
Yi,Tan,Kunhua,et al.Heterologous Biosynthesis of Spinosad:An Omics
‑
Guided Large Polyketide Synthase Gene Cluster Reconstitution in Streptomyces[J].Acs Synth Biol,2017.)中的检测方法，利用LC
‑
MS检测发酵物的成分，结果(图1)显示，在发酵液中能检测到多杀菌素A和多杀菌素D；随后用HPLC(图2)分析，多杀菌素A和多杀菌素D的产量总和约为4.1g/L，其中A组分约占95％，D组分约占5％。
[0030]3、菌株WHU1107的鉴定
[0031]对菌株WHU1107进行鉴定，菌株WHU1107的16s rRNA序列如SEQ ID NO.1所示，与GENBANK ACCESSION NR_024839.1的序列相似性最高，相似性为99％。根据以上结果，菌株WHU1107属于刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)。
[0032]4、菌株WHU1107的保藏
[0033]菌株WHU1107，属于刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)，已于2021年3月31日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址：中国.武汉.武汉大学)，保藏编号为CCTCC NO：M 2021307。
[0034]5、菌株WHU1107和其他刺糖多孢菌菌株产量比较
[0035]前人文献或专利报道的经过诱变等方法获得的多杀高产菌株摇瓶产量约为1
‑
2g/L，远低于本专利技术WHU1107菌株4g/L的产量。按照上述发酵方法检测市场上可购买到的刺糖多孢菌野生型菌株NRRL18395产多杀菌素的情况，其产量为78.7mg/L，其中A组分约占84％，D组分约在16％，也远低于WHU1107菌株4g/L的产量。这些结果说明WHU1107的产量高达4g/L是其自身高产多杀菌素的表现，其可作为多杀菌素高产的工业化菌株进行开发。
[0036]上述实施例为本专利技术较佳的实施方式，但本专利技术的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本专利技术的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本专利技术的保护范围之内。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株高产多杀菌素的刺糖多孢菌，其特征在于：为保藏编号为CCTCC NO：M 2021307的刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)WHU1107。2.根据权利要求1所述的刺糖多孢菌，其特征在于：所述的多杀菌素包括多杀菌素A和多杀菌素D。3.权利要求1所述的刺糖多孢菌在生产多杀菌素中的应用。4.根据权利要求3所述的的应用，其特征在于：所述的多杀菌素包括多杀菌素A和多杀菌素D。5.一种生产多杀菌素的方法，其特征在于：包括以下步骤：将权利要求1所述的刺糖多孢菌接种到发酵培养基中，通过发酵得到含多杀菌素的发酵...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘天罡，刘然，邓子新，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：