烯酮还原酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了烯酮还原酶突变体及其在不对称加氢制备布瓦西坦中间体的应用。所述突变体是通过对氨基酸序列为SEQ ID NO:2所示的野生型烯酮还原酶进行突变改造后得到的突变体。该烯酮还原酶突变体在不对称还原4

【技术实现步骤摘要】
烯酮还原酶突变体及其应用


[0001]本专利技术涉及医药中间体
，具体涉及应用生物酶法不对称生物合成布瓦西坦中间体，更具体地，涉及烯酮还原酶突变体及其应用。

技术介绍

[0002]布瓦西坦(Brivaracetam)(化学名称为(2S)
‑2‑
((4R)
‑2‑
氧代
‑4‑
丙基
‑1‑
吡咯烷基)
‑
丁酰胺，化学结构式如下所示)是由比利时优时比(UCB)公司开发的第三代抗癫痫药物(商品名为)。于2016年1月14日和2016年2 月18日分别在欧洲和美国上市，用于成人及16岁及以上青少年癫痫患者的部分发作，伴有或不伴有继发性全身性发作的辅助治疗。作用机制与左乙拉西坦一致，但与脑内突出囊泡蛋白(SV2A)结合力强于左乙拉西坦10倍；药代动力学参数、药理学特性及安全性也明显优于左乙拉西坦。目前左乙拉西坦的市场表现良好，如2011
‑
2015年间左乙拉西坦的平均年销售额超过10亿美元。而优于左乙拉西坦临床表现的布瓦西坦，具有良好的市场预期，开发其新的合成技术，具有重要的经济价值和社会意义。
[0003][0004]已报道的布瓦西坦的合成方法包括化学法不对称合成、化学法手性拆分、酶法手性拆分和酶法不对称合成。由于布瓦西坦存在两个手性中心，酶法不对称合成被认为是最具技术竞争优势的方法。近几年，酶法C＝C不对称加氢合成布瓦西坦中间体的方法也陆续报道，包括CN107604018A、CN109852644A、 CN111154735A、CN111286509A和CN112143764A。CN107604018A虽然公开了烯酮还原酶对底物4
‑
正丙基呋喃
‑
2(3H)
‑
酮(化合物II)的C＝C不对称加氢法而制备布瓦西坦中间体(R)
‑4‑
正丙基二氢呋喃
‑
2(5H)
‑
酮(化合物I)的应用，但是缺乏关键酶信息，其实际应用效果未知。CN111154735A也公开了应用烯酮还原酶制备化合物I方法所涉及的酶相关信息和产物ee值，但是底物转化率未知。CN109852644A和CN112143764A选择了不同的底物，即不同的布瓦西坦中间体合成路线。总体上，以化合物II为底物的酶法不对称加氢制备布瓦西坦中间体化合物I，已有报道的方法中，其底物转化率未知，酶催化效率不明确等问题。
[0005]现有技术虽然存在对烯酮还原酶突变体进行突变改造的技术，例如 CN111041009A公开了一种烯烃还原酶OYE1突变体，其在116位和/或37位氨基酸位点具有取代突变，与本申请序列存在一定差异；The role of threonine37in flavin reactivity of the old yellow enzyme公开了在第37位进行OYE1改造，The Effects of Active Site Mutations on Old Yellow Enzyme 1公开了在第116 和37位的突变株改造，上述现有技术
虽然存在一定的改进基础但仍然存在活性不高的问题。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供一种烯酮还原酶突变体及其应用。
[0007]在一个方面，本专利技术提供了一种烯酮还原酶突变体，其由氨基酸序列如 SEQ ID NO:2所示的野生型烯酮还原酶在选自第73、117、119、197、252、 253、296、297、376之中的一个或多个位点进行突变获得。
[0008]所述突变的方式为将上述位点的氨基酸突变为A、G、V、L、I、P、F、 Y、W、S、T、C、M、N、Q、D、E、K、R、H中的一种。优选的突变为丙氨酸A突变。
[0009]在一个实施方案中，突变进一步优选为在第296位进行突变。
[0010]进一步的，所述第296位的突变选自P296A、P296C、P296D、P296E、 P296F、P296G、P296H，P296L，P296I，P296M，P296N，P296Q， P296R，P296S，P296T，P296V，P296W，P296K，P296Y中的一个。优选 P296A。
[0011]进一步的，所述烯酮还原酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，或者与SEQ ID NO:3保持同等功能的70％以上、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上85％以上、86％以上、87％以上、 88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、 95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上同一性的变体，以及氨基酸片段或在严格条件下杂交的序列。
[0012]在一个方面，本专利技术提供了编码所述烯酮还原酶突变体的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，或者与SEQ ID NO:4保持同等功能的70％以上、 71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以上、76％以上、77％以上、 78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上同一性的变体，以及氨基酸片段或在严格条件下杂交的序列。
[0013]在一个方面，本专利技术提供了一种重组质粒，所述重组质粒包含编码本专利技术烯酮还原酶突变体的基因。
[0014]在一个方面，本专利技术提供了一种重组菌，所述重组菌包含编码本专利技术烯酮还原酶突变体的基因。
[0015]在一个方面，本专利技术提供了烯酮还原酶突变体或编码所述烯酮还原酶突变体的基因在酶催化不对称还原4
‑
丙基
‑
2(5H)
‑
呋喃酮(化合物II)制备布瓦西坦中间体(R)
‑4‑
正丙基二氢呋喃
‑
2(5H)
‑
酮(化合物I)中的应用。
[0016]上述应用包括：构建含有所述突变体编码基因的重组菌，以重组菌经发酵培养获得的湿菌体或菌体经破碎获得的含酶制剂为催化剂，对化合物II进行不对称加氢反应，获得化合物I。
[0017]所述不对称加氢反应是在NAD(P)
+
/NAD(P)H辅酶循环系统协同作用下进行，所述辅酶循环系统选自醇脱氢酶/异丙醇、甲酸脱氢酶/甲酸盐、葡萄糖脱氢酶/葡萄糖。
[0018]在不对称加氢反应体系中，含烯酮还原酶突变体的细胞用量为5～50g/L 的湿细胞，辅酶细胞的用量为2～5g/L的湿细胞，化合物II用量为0.1％～1.0％， NAD(P)
+
用量为
0.05～0.2mM，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种烯酮还原酶突变体，其特征在于，其由氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的野生型烯酮还原酶在选自第73、117、119、197、252、253、296、297、376之中的一个或多个位点进行突变而获得。2.如权利要求1所述的烯酮还原酶突变体，其特征在于，所述突变为将所述位点的氨基酸突变为A、G、V、L、I、P、F、Y、W、S、T、C、M、N、Q、D、E、K、R、H中的一种。3.如权利要求2所述的烯酮还原酶突变体，其特征在于，所述突变为丙氨酸A突变。4.如权利要求1或2所述的烯酮还原酶突变体，其特征在于，所述突变为在第296位点进行突变。5.如权利要求4所述的烯酮还原酶突变体，其特征在于，所述第296位点的突变选自P296A、P296C、P296D、P296E、P296F、P296G、P296H，P296L，P296I，P296M，P296N，P296Q，P296R，P296S，P296T，P296V，P296W，P296K，P296Y中的一个。6.如权利要求5所述的烯酮还原酶突变体，其特征在于，所述突变为P296A突变。7.如权利要求6所述的烯酮还原酶突变体，其特征在于，所述烯酮还原酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示或者与SEQ ID NO:3保持70％以上同一性。8.编码如权利要求1
‑
7中任一项所述的烯酮还原酶突变体的基因。9.如权利要求6所述的编码烯酮还原酶突变体的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示或者与SEQ ID NO:4保持70％以上同一性。10.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒包含权利要求8
‑
9任一项所述的编码烯...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈小龙，褚定军，陈翰驰，朱林江，冯佳程，陆跃乐，谢晓强，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：