一种生物酶催化的羟丙基四氢吡喃三醇的合成方法技术

本发明专利技术属于有机合成、精细化学品、日用化学品领域，具体涉及一种生物酶催化的羟丙基四氢吡喃三醇的合成方法。该方法使用包含醛酮还原酶(AKR)和乙醇脱氢酶(ADH)的双酶循环催化系统，在氧化型辅酶II(NADP)的存在下，以异丙醇为还原剂，实现羟丙基四氢吡喃三醇的合成。由于采用了生物酶催化，该方法条件温和，操作简便，污染小，绿色安全，无金属残留，且产物的纯度高，特别适合医药和化妆品活性物的合成。特别适合医药和化妆品活性物的合成。特别适合医药和化妆品活性物的合成。

【技术实现步骤摘要】
一种生物酶催化的羟丙基四氢吡喃三醇的合成方法


[0001]本专利技术属于有机合成、精细化学品、日用化学品领域，具体涉及一种生物酶催化的化妆品活性物羟丙基四氢吡喃三醇的合成方法。

技术介绍

[0002]羟丙基四氢吡喃三醇(CAS号439685
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7)是一种生物活性物质，可以对抗皮肤老化、脱水等症状，被广泛应用于食品、生物、医药、化妆品等诸多领域。对于羟丙基四氢吡喃三醇的合成方法，目前公开的文献主要通过丙酮基四氢吡喃三醇(CAS号439685
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1)的还原实现(如下式)。其中，主要的还原条件包括硼氢化钠还原和过渡金属催化下的氢化反应等。这些常规化学还原反应存在以下的一些问题:立体选择性不高；三废排放较高，环境污染严重；一些试剂较为昂贵；一些反应需要高压氢气，存在安全隐患等。特别值得提出的是，一些使用过渡金属催化的反应，在产品中会存在金属残留，这对于医药和化妆品活性物尤为不利。
[0003][0004]本专利技术提供一种生物酶催化的化妆品活性物羟丙基四氢吡喃三醇的合成方法。该方法的特点在于使用包含醛酮还原酶(AKR)和乙醇脱氢酶(ADH)的双酶循环催化系统，在氧化型辅酶II(NADP)的存在下，以异丙醇为还原剂，实现羟丙基四氢吡喃三醇的高选择性、高效合成。该生物酶催化的方法，条件温和，操作简便，污染小，绿色安全，无金属残留，产物的非对映异构体比例高，特别适合医药和化妆品活性物的合成，具有良好的工业应用前景。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种生物酶催化的羟丙基四氢吡喃三醇的合成方法，该方法使用包含醛酮还原酶(AKR)和乙醇脱氢酶(ADH)的双酶循环催化系统，在氧化型辅酶II(NADP) 的存在下，以异丙醇为还原剂，实现羟丙基四氢吡喃三醇的合成。其中，AKR主导丙酮基四氢吡喃三醇的还原，ADH主导NADPH的循环反应，示意式如下：
[0006]454mL去离子水，搅拌使充分溶解，抽滤出去颗粒。室温避光保存。
[0021](7)蛋白质电泳脱色液：50mL无水乙醇，75mL冰醋酸，875mL去离子水，混匀，须现配现用。
[0022](8)16％SDS
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PAGE分离胶(10mL)：3.3mL去离子水，4mL Acr(40％)，2.5mL 1M Tris
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HCl (pH 8.8)，100μL 10％SDS，100μL 10％APS，10μL TEMED。
[0023](9)5％SDS
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PAGE浓缩胶(5ml)：2.42mL去离子水，0.5mL Acr(40％)，1.0mL，0.5M Tris
‑ꢀ
HCl(pH 6.8)，40μL 10％SDS，40μL 10％APS，5μL TEMED。
[0024](10)0.2mol
·
L
‑1，pH＝7.0的PBS(磷酸盐缓冲液)：
[0025]A试液：0.2mol
·
L
‑1磷酸二氢钠水溶液：31.20g NaH2PO4
·
2H2O，去离子水定容至1L。
[0026]B试液：0.2mol
·
L
‑1磷酸氢二钠水溶液：28.40g Na2HPO4
·
2H2O，去离子水定容至1L。最终将A试液加入至B试液中调至pH至7.0。
[0027](11)0.2mol
·
L
‑1，pH＝8.0的PBS(磷酸盐缓冲液)：
[0028]A试液：0.2mol
·
L
‑
1磷酸二氢钠水溶液：31.20g NaH2PO4
·
2H2O，去离子水定容至1L。
[0029]B试液：0.2mol
·
L
‑1磷酸氢二钠水溶液：28.40g Na2HPO4
·
2H2O，去离子水定容至1L。最终将A试液加入至B试液中调至pH至8.0。
[0030]实施例2(目的基因的扩增)
[0031]设计醛酮还原酶AKR和乙醇脱氢酶ADH的PCR所需的引物，通过PCR方法在目标基因的碳端和氮端分别插入NdeI以及XhoI酶切位点。
[0032]引物的设计
[0033][0034]设计引物并进行PCR操作，PCR操作时，采用50μL的总反应体系，体系组成如下
[0035]PCR条件：
①
预变性98℃,2min；
[0036]②
变性98℃,10s；退火58℃,5s；延伸72℃,5s/kb；循环35次；
[0037]③
延伸72℃,5min；
[0038]④
4℃,1h(此阶段可随时终止PCR)。
[0039]实施例3(pET
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28a(+)
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adh和pET
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28a(+)
‑
akr重组质粒的构建)
[0040]PCR产物(ADH基因和AKR基因))经双酶切(NdeII和XhoI)后，与同样双酶切的质粒pET
‑ꢀ
28a(+)在22℃条件下连接2h；运用热激法将酶连产物转入E.coli DH5α感受态，经测序鉴定正确后，接着将重组质粒转入E.coli BL21(DE3)，重组质粒命名为pET
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28a(+)
‑
adh和 pET
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28a(+)
‑
akr，之后将菌种放至
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80℃冰箱中保存。
[0041]实施例4(菌种的诱导表达及保存)
[0042](1)醛酮还原酶的诱导
[0043]挑取并过夜培养测序正确的菌种，待其过夜摇菌后加入1
‰
的抗性卡那霉素以及1％的过夜培养菌种，37℃、220rpm振荡培养至OD600值为0.6
‑
0.8后，加入36μL的IPTG诱导剂 (异丙基
‑
β
‑
D
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硫代吡喃半乳糖苷)，再迅速降温到22℃，以180rpm的振荡速度连续振荡培养15h。
[0044](2)乙醇脱氢酶的诱导
[0045]挑取并过夜培养测序正确的菌种，待其过夜摇菌后加入1
‰
的抗性卡那霉素以及1％的过夜培养菌种，37℃、220rpm振荡培养至OD600值为0.6
‑
0.8后，加入60μL的IPTG诱导剂 (异丙基
‑
β
‑
D
‑
硫代吡喃半乳糖苷)，再迅速降温到18℃，以220rpm的振荡速度连续振荡培养8h。
[0046](3)诱导产物的保存
[0047]首先将诱导后的酶液平均分成四小管，在8000rpm，5min条件下离心，去掉上清液，在试管中本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种生物酶催化的羟丙基四氢吡喃三醇的合成方法，其以丙酮基四氢吡喃三醇和异丙醇为原料，在含有醛酮还原酶(AKR)、乙醇脱氢酶(ADH)和氧化型辅酶II(NADP)的水相缓冲溶液中反应，从而制备羟丙基四氢吡喃三醇。2.根据权利要求1所述所合成羟丙基四氢吡喃三醇的方法，其特征在于，所述醛酮还原酶(AKR)和乙醇脱氢酶(ADH)通过外源基因在大肠杆菌中表达合成。3.根据权利要求1和2所述所合成羟丙基四氢吡喃三醇的方法，其特征在于，所述醛酮还原酶(AKR)的基因序列为：ATGCTGTACAAAGAACTGGGCCGTACCGGTGAAGAAATTCCGGCCTTAGGCTTAGGCACCTGGGGTATTGGCGGCTTTGAAACCCCGGATTATTCTCGCGATGAAGAAATGGTGGAACTGTTAAAAACCGCAATTAAAATGGGCTATACCCATATTGATACCGCAGAATATTATGGCGGCGGTCATACCGAAGAACTGATTGGTAAAGCCATTAAAGATTTTCGTCGCGAGGATCTGTTTATTGTGTCTAAAGTGTGGCCGACCCATCTGCGCCGTGATGATCTGCTGCGCTCTCTGGAAAATACCCTGAAACGTTTAGATACCGATTATGTGGATCTGTATCTGATTCATTGGCCGAATCCGGAAATTCCGCTGGAAGAAACCCTGAGTGCAATGGCAGAAGGCGTGCGTCAGGGCTTAATTCGCTATATTGGTGTGAGTAATTTTGATCGTCGCCTGCTGGAAGAAGCCATTTCTAAATCACAGGAACCGATTGTTTGTGATCAGGTTAAATATAATATTGAAGATCGCGATCCGGAACGCGATGGTTTACTGGAATTTTGTCAGAAAAATGGCGTGACCTTAGTTGCCTATAGTCCGTTACGTCGTACCTTACTGAGTGAAAAAACCAAACGCACCTTAGAAGAAATTGCCAAAAATCATGGTGCCACCATATACCAGATTATGTTAGCATGGCTGTTAGCCAAACCGAATGTGGTTGCAATTCCGAAAGCAGGTCGTGTTGAACATCTGCGCGAAAATCTGAAAGCAACCGAAATTAAACTGAGCGAAGAAGAGATGAAACTGCTGGATAGTCTGGG TTAA；AKR蛋白质序列为：MLYKELGRTGEEIPALGLGTWGIGGFETPDYSRDEEMVELLKTAIKMGYTHIDTAEYYGGGHTEELIGKAIKDFRREDLFIVSKVWPTHLRRDDLLRSLENTLKRLDTDYVDLYLIHWPNPEIPLEETLSAMAEGVRQGLIRYIGVSNFDRRLLEEAISKSQEPIVCDQVKYNIEDRDPERDGLLEFCQKNGVTLVAYSPLRRTLLSEKTKRTLEEIAKNHGATIYQIMLAWLLAKPNVVAIPKAGRVEHLRENLKATEIKLSEEEM KLLDSLG4.根据权利要求1和2所述所合成羟丙基四氢吡喃三醇的方法，其特征在于，ADH基因序列为：ATGAGCAATCGTCTGGATGGTAAAGTTGCAATTATTACCGGCGGAACTTTAGGTA...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴江，张伟，朱纯银，周宝萍，
申请(专利权)人：上海克琴科技有限公司，
类型：发明
国别省市：