过渡金属氧化物纳米探针、制备方法及应用技术

公开一种过渡金属氧化物纳米探针、制备方法及应用，成本较低，可对特定蛋白进行荧光成像，并可用于多种蛋白同时成像。这种过渡金属氧化物纳米探针，其包括：过渡金属氧化物纳米颗粒以及复合在过渡金属氧化物纳米颗粒表面的修饰分子，所述过渡金属氧化物包括铁、钴、镍三种元素的氧化物或氢氧化物，所述表面修饰分子包括生物蛋白分子、生物素分子、荧光素分子。荧光素分子。荧光素分子。

【技术实现步骤摘要】
过渡金属氧化物纳米探针、制备方法及应用


[0001]本专利技术涉及纳米材料和生物分析的
，尤其涉及一种过渡金属氧化物纳米探针，这种探针的制备方法，以及该过渡金属氧化物纳米探针在细胞特定蛋白成像分析中的应用。

技术介绍

[0002]纳米探针是一类基于自身理化性质，可用于某一医学影像仪器辅助提升成像质量的纳米材料。目前用于单细胞水平蛋白质分子成像的纳米探针中的大多数纳米探针是基于使用抗体
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抗原免疫效应原理，通过信号选择最多可实现对5
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8种标志物的成像，但仅适合对高丰度表达蛋白的半定量分析。而基于无机金属元素标记的二抗标签能够实现几十种蛋白分子的表达分析，这种基于无机质谱的定量分析方法定量的灵敏度很高，但其破坏性的定量过程，导致蛋白的空间分布信息的缺失。同时，虽然采取二抗来识别一抗可以实现信号放大和成像，但是二抗对金属标签的载带量有限，且价格相对昂贵，并具有一抗物种选择性。因此，设计一种较低成本的、可实现单细胞水平特定蛋白质靶向的广谱成像的纳米探针是目前领域内研究人员广为开展的热点研究之一。

技术实现思路

[0003]为克服现有技术的缺陷，本专利技术要解决的技术问题是提供了一种过渡金属氧化物纳米探针及其制备方法，其成本较低，可对特定蛋白进行荧光成像，并可用于多种蛋白同时成像。
[0004]本专利技术的技术方案是：这种过渡金属氧化物纳米探针，其包括：过渡金属氧化物纳米颗粒以及复合在过渡金属氧化物纳米颗粒表面的修饰分子，所述过渡金属氧化物包括铁、钴、镍三种元素的氧化物或氢氧化物，所述表面修饰分子包括生物蛋白分子、生物素分子、荧光素分子。
[0005]过渡金属氧化物纳米探针的制备方法，其包括以下步骤：
[0006](1)将生物素、N
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羟基琥珀酰亚胺NHS和1
‑
乙基
‑3‑
(3
′
二甲基氨基丙基)碳二亚胺EDC的混合物溶于2
‑
(N
‑
吗啉)乙磺酸MES缓冲溶液中，在室温避光情况下剧烈搅拌一段时间，得到活化生物素溶液；之后高速离心纯化，得到活化生物素，并重新溶解于二甲基亚砜DMSO中，得到第一溶液；
[0007](2)将5～50克/升生物蛋白分子溶液溶于碳酸氢钠缓冲液中，混匀后得到第二溶液；
[0008](3)将第一溶液与第二溶液混合均匀，反应一段时间，得到生物素蛋白，之后透析得到纯化的生物素蛋白溶液；
[0009](4)将含过渡金属元素溶液与生物素蛋白溶液混合反应一段时间后，加入氢氧化钠水溶液调节pH至10以上，在37摄氏度条件下恒温继续剧烈搅拌一段时间，之后静置一段时间陈化，得到过渡金属氧化物纳米颗粒溶液，并透析提纯；
[0010](5)在步骤(4)得到的过渡金属氧化物纳米颗粒溶液中，加入pH为9的碳酸氢钠缓冲液，并将溶液置于4摄氏度环境中搅拌使其温度降至接近4摄氏度；碳酸氢钠缓冲液后最终浓度以蛋白质分子浓度测算为0.5～10毫克/毫升；
[0011](6)将一定浓度的RBITC或FITC的二甲基甲酰胺DMF或二甲亚枫DMSO溶液缓慢滴加到步骤(5)的反应液中；快速注入一定浓度的氯化铵溶液以终止偶联反应；继续搅拌1～5小时后，停止搅拌，并进行透析纯化处理，得到最终的过渡金属氧化物纳米探针。
[0012]与抗体作为修饰分子的纳米探针相比，本专利技术基于生物素与链霉亲和素之间的特异性结合的特点，使用更加廉价的生物素修饰与纳米颗粒表面，从而大大降低了探针的制备成本，同时，也摆脱了抗体仅特异性结合特定蛋白的束缚，可同时实现多种蛋白的共同成像，并可结合探针中过渡金属元素的含量，对特定蛋白在细胞中的表达量进行定量分析。
[0013]还提供了所述过渡金属氧化物纳米探针应用于荧光成像实验，方法为：对细胞特定蛋白进行成像分析时，先将所选用的细胞系消化后种于盖玻片上并固定后分别使用血清白蛋白和生物素封闭试剂盒对细胞进行封闭处理；接着与商业化的特定蛋白的生物素化抗体进行一抗共孵育12小时；孵育结束后，使用PBS冲洗三次，将处理的细胞与Chromeo
TM 546链霉亲和素SC
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364714于37摄氏度环境中继续孵育1小时；随后使用PBS冲洗三次，将细胞继续与步骤(6)得到的纳米探针溶液于37摄氏度环境中继续孵育一段时间，使用PBS冲洗三次后，进行荧光成像实验。
附图说明
[0014]图1为本专利技术所制备的一系列功能性荧光纳米探针的合成与功能化示意图；
[0015]图2为本专利技术实施例1、2、3、4制备的一系列过渡金属氧化物纳米探针的动态光散射表征曲线图；
[0016]图3为本专利技术实施例5所述的使用本专利技术实施例1制备的氧化铁纳米探针用于HER
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2蛋白荧光成像图；
[0017]图4为本专利技术实施例6所述的使用本专利技术实施例2制备的氢氧化钴纳米探针以及本专利技术实施例4制备的四氧化三铁纳米探针用于HER
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2蛋白和Ki67蛋白同时荧光成像图。
[0018]图5为根据本专利技术的过渡金属氧化物纳米探针的制备方法的流程图。
具体实施方式
[0019]这种过渡金属氧化物纳米探针，其包括：过渡金属氧化物纳米颗粒以及复合在过渡金属氧化物纳米颗粒表面的修饰分子，所述过渡金属氧化物包括铁、钴、镍三种元素的氧化物或氢氧化物，所述表面修饰分子包括生物蛋白分子、生物素分子、荧光素分子。
[0020]优选地，所述过渡金属氧化物纳米探针的水合粒径为10～50纳米。
[0021]优选地，所述过渡金属氧化物中的过渡金属元素与所述生物蛋白分子的摩尔比为1：a，a为0.005～0.1。
[0022]优选地，所述生物蛋白分子和生物素分子的摩尔比例是1：b，b为5～100；生物蛋白分子与荧光素分子摩尔比例为1：d，d为1～10
[0023]优选地，所述过渡金属氧化物纳米探针用于细胞内特定蛋白质原位成像时，将细胞进行生物素修饰的所述特定蛋白质的抗体标记处理，并进行链霉亲和素孵育处理。
[0024]优选地，所述生物蛋白分子是牛血清白蛋白、人血清白蛋白、铁红蛋白、纤连蛋白、蛋清蛋白中的一种或多种。
[0025]优选地，所述荧光素分子是罗丹明B异硫氰酸酯RBITC或异硫氰酸荧光素FITC。
[0026]如图5所示，还提供了这种过渡金属氧化物纳米探针的制备方法，其包括以下步骤：
[0027](1)将生物素、N
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羟基琥珀酰亚胺NHS和1
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乙基
‑3‑
(3
′
二甲基氨基丙基)碳二亚胺EDC的混合物溶于2
‑
(N
‑
吗啉)乙磺酸MES缓冲溶液中，在室温避光情况下剧烈搅拌一段时间，得到活化生物素溶液；之后高速离心纯化，得到活化生物素，并重新溶解于二甲基亚砜DMSO中，得到第一溶液；
[0028](2)将5～50克本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.过渡金属氧化物纳米探针，其特征在于：其包括：过渡金属氧化物纳米颗粒以及复合在过渡金属氧化物纳米颗粒表面的修饰分子，所述过渡金属氧化物包括铁、钴、镍三种元素的氧化物或氢氧化物，所述表面修饰分子包括生物蛋白分子、生物素分子、荧光素分子。2.根据权利要求1所述的过渡金属氧化物纳米探针，其特征在于：所述过渡金属氧化物纳米探针的水合粒径为10～50纳米。3.根据权利要求2所述的过渡金属氧化物纳米探针，其特征在于：所述过渡金属氧化物中的过渡金属元素与所述生物蛋白分子的摩尔比为1：a，a为0.005～0.1。4.根据权利要求3所述的过渡金属氧化物纳米探针，其特征在于：所述生物蛋白分子和生物素分子的摩尔比例是1：b，b为5～100；生物蛋白分子与荧光素分子摩尔比例为1：d，d为1～10。5.根据权利要求4所述的过渡金属氧化物纳米探针，其特征在于：所述过渡金属氧化物纳米探针用于细胞内特定蛋白质原位成像时，将细胞进行生物素修饰的所述特定蛋白质的抗体标记处理，并进行链霉亲和素孵育处理。6.根据权利要求5所述的过渡金属氧化物纳米探针，其特征在于：所述生物蛋白分子是牛血清白蛋白、人血清白蛋白、铁红蛋白、纤连蛋白、蛋清蛋白中的一种或多种。7.根据权利要求6所述的过渡金属氧化物纳米探针，其特征在于：所述荧光素分子是罗丹明B异硫氰酸酯RBITC或异硫氰酸荧光素FITC。8.根据权利要求1所述的过渡金属氧化物纳米探针的制备方法，其特征在于：其包括以下步骤：(1)将生物素、N
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羟基琥珀酰亚胺NHS和1
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乙基
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(3
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二甲基氨基丙基)碳二亚胺EDC的混合物溶于2
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(N
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吗啉)乙磺酸MES缓冲溶液中，在室温避光情况下剧烈搅拌一段时间，得到活化生物素溶液；之后高速离心纯化，得到活化生物素，并重新溶解于二甲基亚砜DMSO中，得到第一溶液；(2)将5～50克/升生物蛋白分子溶液溶于碳酸氢钠缓冲液中，混匀后得到第二溶液；(3)将第一溶液与第二溶液混合均匀，反应一段时间，得到生物素蛋白，之后透析得到纯化的生物素蛋白溶液；(4)将含过渡金属元素溶液与生物素蛋白溶液混合反应一段时间后，加入氢氧化钠水溶液调节pH至10以上，在37摄氏度条件下恒温继续剧烈搅拌一段时间，之后静置一段时间陈化，得到过渡金属氧化物纳米颗粒溶液，并透析提纯；(5)在步骤(4)得到的过渡金属氧化物纳米颗粒溶液中，加入pH为9的碳酸氢钠缓冲液，并将溶液置于4摄氏度环境中搅拌使其温度降...

【专利技术属性】
技术研发人员：王亚玲，陈春英，赵宇亮，鲁婧怡，
申请(专利权)人：国家纳米科学中心，
类型：发明
国别省市：