用于密码子扩展的突变tRNA制造技术

在一些实施方案中，本公开涉及其中反密码子的第一个字母已被替换为赖胞苷或胍丁胞苷的突变tRNA，以及包含突变tRNA的翻译系统。在具体实施方案中，本公开提供了能够选择性翻译密码子NNA的突变tRNA。在另一个实施方案中，本公开提供了能够从单个密码子盒翻译两种或三种类型的氨基酸的翻译系统。在又一个实施方案中，本公开提供用于合成赖胞苷二磷酸、胍丁胞苷二磷酸及其衍生物的新方法。苷二磷酸及其衍生物的新方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于密码子扩展的突变tRNA


[0001]本公开涉及tRNA和翻译系统，以及其使用方法。

技术介绍

[0002]展示文库是一种非常有用的技术，通过它可以以进化工程的方式有效地获得与靶蛋白结合的分子。为了使用展示文库获得对任意靶分子表现出高结合能力的分子，或者获得多个分别结合不同表位的分子，需要对高度多样化的文库进行淘选。为了构建高度多样化的文库，可以增加文库的结构单元的数量或种类；然而，当从膜透性的角度对分子量有限制时，结构单元的数量也会受到限制。因此，增加结构单元多样性的策略对于增加文库多样性很重要。
[0003]在重构的无细胞翻译系统如PURESYSTEM(非专利文献(NPL)1)中，由于氨基酸、tRNA和氨酰tRNA合成酶(ARS)等成分的浓度可以调整，天然密码子
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氨基酸对应关系可能会发生改变。此类翻译系统的使用使得能够构建展示文库，其中引入了20种或更多不同种的任意结构单元。然而，在使用三碱基密码子的大肠杆菌(Escherichia coli)翻译系统中，由于摇摆法则，原则上最多只能引入32种不同的结构单元。为了给出更具体的解释，除了Watson
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Crick碱基对，密码子的第三个字母和反密码子的第一个字母的配对存在一些“摇摆(play)”，这允许G和U之间的配对，称为摆动碱基对。因此，反密码子GNN解码NNU和NNC密码子，反密码子UNN解码NNA和NNG密码子。因此，区分这些密码子是不可能的，将可以引入一个密码子框的不同氨基酸的最大数量限制为两个(非专利文献2)。
[0004]另一方面，在自然界中，有方法能够区分AUA和AUG密码子。一个这样的例子是在第34位(反密码子的第一个字母)处引入大肠杆菌tRNA Ile2的赖胞苷修饰。已知这种修饰使tRNA Ile2仅解码AUA密码子，而不解码AUG密码子(非专利文献3)。这种修饰是通过异亮氨酸tRNA
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赖胞苷合成酶(tRNA
Ile
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赖胞苷合成酶；TilS)引入的(非专利文献4)。由于其底物tRNA仅为tRNA Ile2，因此将赖胞苷引入其他tRNA中并不容易(非专利文献5)。
[0005]引用列表
[0006][非专利文献][0007][非专利文献1]Shimizu et al.,Nat Biotechnol.2001 Aug；19(8):751
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755
[0008][非专利文献2]Iwane et al.,Nat Chem.2016 Apr；8(4):317
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325
[0009][非专利文献3]Grosjean et al.,Trends Biochem Sci.2004 Apr；29(4):165
‑
168
[0010][非专利文献4]Suzuki T et al.,FEBS Lett.2010 Jan 21；584(2):272
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277
[0011][非专利文献5]Lajoie et al.,J Mol Biol.2016 Feb 27；428(5 Pt B):1004
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1021

技术实现思路

[0012]技术问题
[0013]如上所述，在第34位(反密码子的第一个字母)将赖胞苷引入tRNA Ile2能够区分AUA和AUG密码子。然而，自然界中没有其他用赖胞苷修饰的tRNA。此外，还没有报道区分NNA和NNG密码子的人工手段。本专利技术是鉴于这种情况而完成的。本公开的目的是提供能够区分NNA和NNG密码子的新方法。
[0014]解决问题的方案
[0015]在本文中，本专利技术人通过酶促反应将化学合成的tRNA片段与赖胞苷(也称为2
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赖氨酰胞苷)连接以制备tRNA，其中在34位引入了赖胞苷，并且在35和36位(反密码子的第二个和第三个字母)具有不同的序列。当重构包含这些tRNA的翻译系统并进行氨基酸翻译时，发现这些翻译系统中的任何一个都能够区分NNA和NNG密码子。此外，在这些检查过程中发现，虽然具有UNN反密码子的tRNA不仅解码NNA和NNG密码子，还解码NNU密码子，但引入赖胞苷的tRNA显著减少了NNU密码子的这种误读。
[0016]本专利技术基于这样的发现，具体包括以下举例说明的实施方案：
[0017][1]通过改造tRNA产生的突变tRNA，其中所述改造包括改造使得在以N1N2N3表示的反密码子中，改造后的第一个字母核苷N1为赖胞苷(k2C)、赖胞苷衍生物、胍丁胞苷(agmatidine)(agm2C)和胍丁胞苷(agmatidine)衍生物中的任一个，其中N2和N3分别为反密码子的第二个字母和第三个字母的任意核苷；
[0018][2]根据[1]所述的突变tRNA，其中改造前的N1是胞苷(C)，并且从所述胞苷(C)改造为赖胞苷(k2C)不能被赖胞苷合成酶(tRNA
Ile
‑
赖胞苷合成酶；TilS)催化，所述赖胞苷合成酶具有SEQ ID NO:51的氨基酸序列；
[0019][3]根据[1]所述的突变tRNA，其中改造前的N1是胞苷(C)，并且从所述胞苷(C)改造为胍丁胞苷(agmatidine)(agm2C)不能被胍丁胞苷(agmatidine)合成酶(tRNA
Ile
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胍丁胞苷(agmatidine)合成酶；TiaS)催化，所述胍丁胞苷(agmatidine)合成酶具有SEQ ID NO:52的氨基酸序列；
[0020][4]根据[1]至[3]中任一项所述的突变tRNA，包含与M1M2A表示的密码子互补的反密码子(其中M1和M2分别表示密码子的第一个和第二个字母的核苷；M1和M2各自选自腺苷(A)、鸟苷(G)、胞苷(C)和尿苷(U)中的任一种；第三个字母的核苷对应于腺苷)；
[0021][5]根据[4]所述的突变tRNA，其中所述反密码子由k2CN2N3或agm2CN2N3表示(其中所述反密码子第一个字母的核苷是赖胞苷(k2C)或胍丁胞苷(agmatidine)(agm2C)，第二个字母(N2)的核苷和第三个字母(N3)的核苷分别与M2和M1互补)；
[0022][6]根据[5]所述的突变tRNA，其中N2和N3各自选自腺苷(A)、鸟苷(G)、胞苷(C)和尿苷(U)中的任一种；
[0023][7]根据[1]至[6]中任一项所述的突变tRNA，其中所述tRNA是起始tRNA或延长子tRNA；
[0024][8]根据[1]至[7]中任一项所述的突变tRNA，其中所述tRNA来源于原核生物或真核生物；
[0025][9]根据[4]至[8]中任一项所述的突变tRNA，其中M1和M2选自构成密码子盒的密码子，其中第三个字母核苷为A的密码子和第三个字母核苷为G的密码子均在天然遗传密码表中编码相同的氨基酸；
[0026][10]根据[4]至[8]中任一项本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.通过改造tRNA产生的突变tRNA，其中所述改造包括改造使得在以N1N2N3表示的反密码子中，改造后的第一个字母核苷N1为赖胞苷(k2C)、赖胞苷衍生物、胍丁胞苷(agmatidine)(agm2C)和胍丁胞苷衍生物中的任一个，其中N2和N3分别为反密码子的第二个字母和第三个字母的任意核苷。2.根据权利要求1所述的突变tRNA，其中改造前的N1是胞苷(C)，并且从所述胞苷(C)改造为赖胞苷(k2C)不能被具有SEQ ID NO:51的氨基酸序列的赖胞苷合成酶(tRNA
Ile
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赖胞苷合成酶；TilS)催化。3.根据权利要求1所述的突变tRNA，其中改造前的N1是胞苷(C)，并且从所述胞苷(C)改造为胍丁胞苷(agm2C)不能被具有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的胍丁胞苷合成酶(tRNA
Ile
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胍丁胞苷合成酶；TiaS)催化。4.根据权利要求1至3中任一项所述的突变tRNA，其包含与M1M2A表示的密码子互补的反密码子(其中M1和M2分别表示密码子的第一个和第二个字母的核苷；M1和M2各自选自腺苷(A)、鸟苷(G)、胞苷(C)和尿苷(U)中的任一种；并且第三个字母的核苷是腺苷)。5.根据权利要求4所述的突变tRNA，其中所述反密码子由k2CN2N3或agm2CN2N3表示(其中所述反密码子的第一个字母的核苷是赖胞苷(k2C)或胍丁胞苷(agm2C)，第二个字母(N2)的核苷和第三个字母(N3)的核苷分别与M2和M1互补)。6.根据权利要求4或5所述的突变tRNA，其中M1和M2选自构成密码子盒的密码子，所述密码子盒中第三个字母核苷为A的密码子和第三个字母核苷为G的密码子在天然遗传密码表中均编码相同的氨基酸。7.根据权利要求4或5所述的突变tRNA，其中M1和M2选自构成密...

【专利技术属性】
技术研发人员：筱原正次郎，谷口贵昭，美细津美树，西村香绪梨，岩桥万奈，江村岳，中野効彦，田中正彦，大岳崇伦，太田淳，
申请(专利权)人：中外制药株式会社，
类型：发明
国别省市：