一种rRNA沉默的RNA文库构建方法及试剂盒技术

本发明专利技术提供一种制备rRNA沉默的RNA文库的方法及其使用的试剂或试剂盒。方法及其使用的试剂或试剂盒。方法及其使用的试剂或试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
RNAmoiety of DNA
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RNA hybrids.Eur J Biochem/FEBS 1970；14(2)：278
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83)。该方法中，总RNA首先使用一系列针对rRNA的特异性引物混合物进行杂交或反转录，然后加入RNA酶H以降解DNA：RNA杂交双链中的rRNA，继而再加入DNA酶I以降解残留的DNA。JohnMorlan利用此原理设计是针对人/大鼠/小鼠的5S、18S、28S rRNA的短的反义DNA探针(50
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80bp)。将这些探针与人体RNA杂交后用RNA酶H和DNA酶I处理，该方法可去除98％的rRNA。基于RNA酶H，DNA酶I消化技术的缺点是十分显著的：第一，由于利用的引物是针对目标RNA设计的，要达到这些引物不与非目标RNA杂交的可能性是极低的，所以极有可能在最终的目标RNA中存在部分非目标RNA；第二，目标RNA是在经过RNA酶H，DNA酶I等一系列处理后得到的，而RNA是极易被污染、被降解，目标RNA去除步骤越多，其被降解的可能性越大。
[0008]利用特异性探针的消减杂交技术，消减杂交利用rRNA的反义序列作为特异性探针，因而rRNA与结合在微球或磁珠上的探针杂交后，杂交分子可以从溶液中去除。该方法是目前使用最为广泛的技术，如Ambion公司的MICROB Express kit，使用两步连续杂交将rRNA捕获于磁珠上。试剂盒使用上有明确的物种局限，所有古生菌样本均不适用；且受限于所用探针种类与数量，该试剂盒对RNA样品的完整性要求很高—
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降解的rRNA往往会丢失杂交位点而无法被有效去除。另有较为晚近的Epicentre公司研发的Ribo
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Zero kit，使用的则是偶联生物素的特异性探针，因而rRNA与之杂交后可用相应的链霉亲合素包被的亲和层析磁珠去除。

技术实现思路

[0009]本专利技术目的在于为制备RNA测序文库提供一种简单快速的rRNA沉默的方法和试剂盒，相比于RNA酶H消化法，减少步骤，时间由3小时缩短到了15分钟，从而降低对RNA的破坏。
[0010]在一个方面，本专利技术提供一种5
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端封闭的rRNA特异性寡核苷酸，其具有5
’
端封闭模块和3
’
端rRNA特异性序列(有或无别的序列)，所述封闭模块阻断5
’
末端的连接(例如连接衔接头)，所述rRNA特异性序列与rRNA靶序列至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％互补。5
’
端封闭意味着本专利技术的寡核苷酸不能在5
’
端连接本文所述衔接头，使得自rRNA衍生的dsDNA因连接不上衔接头而无法利用对衔接头特异性的引物进行有效扩增，继而形成文库，例如用于测序。
[0011]在一个实施方案中，所述5
’
端封闭模块是对5
’
末端核苷(酸)的5
’‑
磷酸基团或5
’‑
羟基的修饰。在进一步的实施方案中，所述修饰是5
’‑
磷酸基团的酯化或酰胺化或5
’‑
羟基的酯化或醚化。在进一步的实施方案中，所述修饰是5
’
位连接间隔子序列，例如5
’
间隔子18、5
’
间隔子9、5
’
C3
‑
间隔子、5
’
C6
‑
间隔子、5
’
无碱基残基(d间隔子、r间隔子)、5
’‑5’
反向核苷酸。在一个实施方案中，所述5
’
端核苷酸的碱基不是胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和尿嘧啶中的任一者。在一个实施方案中，所述5
’
端核苷酸的脱氧核糖的2
’
氢中的一个或两个被另一个原子或封闭模块取代。在一个实施方案中，所述寡核苷酸包含具有戊糖的5
’
端核苷酸，所述戊糖的立体构象不同于RNA或DNA中的核糖或脱氧核糖的立体构象。关于5
’
封闭，参见WO2017/032808或CN107849561A，通过援引将其引入本文用于所有目的。
[0012]在另一个实施方案中，所述3
’
端rRNA特异性序列和/或所述rRNA靶序列具有例如4nt至100nt、6nt至75nt、10nt至60nt、20nt至50nt或30nt至40nt的长度，包括所述范围内的任一整数的长度，例如4nt、5nt、6nt、7nt、8nt、9nt、10nt、11nt、12nt、13nt、14nt、15nt、
20nt、25nt、30nt、35nt、40nt、45nt、50nt、55nt、60nt、65nt、70nt或75nt的长度。
[0013]在另一个实施方案中，所述rRNA特异性序列是对28S、26S、25S、18S、5.8S或5S真核细胞质rRNA或16S或12S真核线粒体rRNA或23S、16S或5S原核rRNA特异性的，和/或所述rRNA靶序列来自28S、26S、25S、18S、5.8S或5S真核细胞质rRNA或16S或12S真核线粒体rRNA或23S、16S或5S原核rRNA。
[0014]在另一个实施方案中，所述rRNA靶序列是rRNA的保守序列或共有序列。
[0015]在另一个实施方案中，所述3
’
端rRNA特异性序列包含简并核苷酸。
[0016]在另一个实施方案中，所述寡核苷酸的碱基经过修饰，例如5
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Methyl dC、Super T和/或2，6
‑
Amino
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dA，能够与rRNA稳定退火成杂合链，并延伸。在进一步的实施方案中，所述寡核苷酸中的所有C均为经过修饰的。在进一步的实施方案中，所述寡核苷酸中的所有T均为经过修饰的。在进一步的实施方案中，所述寡核苷酸中的所有A均为经过修饰的。
[0017]在另一个实施方案中，所述rRNA来自感兴趣的物种，包括但不限于哺乳动物，例如灵长动物或啮齿动物，又例如人、食蟹猴、小鼠、大鼠、兔、犬、猫、牛、马、羊、猪。
[0018]在另一个实施方案中，所述rRNA来自感兴趣的微生物，例如细菌或真菌，包括但不限于大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母。
[0019]在另一个实施方案中，所述寡核苷酸包含选自SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.119的任意一种。
[0020]在另一个方面，本专利技术提供一种寡核苷酸集合，其包含多种本专利技术的寡核苷酸，且是对同一类rRNA，例如28S、26S、25S、18S、5.8S或5S真核细胞质rRNA或16S或12S真核线粒体rRNA或23S、16S或5S原核rRNA之一特异性的。
[0021]在一个实施方案中，所述多种寡核苷酸的rRNA靶本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种5
’
端封闭的rRNA特异性寡核苷酸，其特征在于，具有5
’
端封闭模块和3
’
端rRNA特异性序列，所述封闭模块阻断5
’
末端的连接，所述rRNA特异性序列与rRNA靶序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％互补，任选地，所述5
’
端封闭模块是对5
’
末端核苷(酸)的5
’‑
磷酸基团或5
’‑
羟基的修饰，进一步任选地，所述修饰是5
’‑
磷酸基团的酯化或酰胺化或5
’‑
羟基的酯化或醚化，或者，所述修饰是5
’
位连接间隔子序列，任选地，所述3
’
端rRNA特异性序列和/或所述rRNA靶序列具有例如4nt至100nt、6nt至75nt、10nt至60nt、20nt至50nt或30nt至40nt的长度，包括所述范围内的任一整数的长度，例如4nt、5nt、6nt、7nt、8nt、9nt、10nt、11nt、12nt、13nt、14nt、15nt、20nt、25nt、30nt、35nt、40nt、45nt、50nt、55nt、60nt、65nt、70nt或75nt的长度。2.根据权利要求1所述的寡核苷酸，其特征在于，所述rRNA特异性序列是对28S、26S、25S、18S、16S、12S、5.8S或5S真核rRNA或23S、16S或5S原核rRNA特异性的，和/或所述rRNA靶序列来自28S、26S、25S、18S、16S、12S、5.8S或5S真核rRNA或23S、16S或5S原核rRNA。3.根据权利要求1所述的寡核苷酸，其特征在于，所述rRNA靶序列是rRNA的保守序列或共有序列。4.根据权利要求1所述的寡核苷酸，其特征在于，所述3
’
端rRNA特异性序列包含简并核苷酸和/或经过修饰的碱基。5.一种寡核苷酸集合，其特征在于，包含多种根据权利要求1
‑
4任一项所述的寡核苷酸，且是对同一类rRNA，例如28S、26S、25S、18S、16S、12S、5.8S或5S真核rRNA或23S、16S或5S原核rRNA之一特异性的，任选地，所述多种寡核苷酸的rRNA靶序列在所述rRNA上彼此交叠、毗邻、断续或其任意组合，任选地，所述多种寡核苷酸的rRNA靶序列在所述rRN...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹林，聂俊伟，瞿志鹏，叶廷跃，韩锦雄，吴恒，景雅，
申请(专利权)人：南京诺唯赞生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：