一种特异识别人PLK1位点的sgRNA、质粒、纳米复合物和应用制造技术

本发明专利技术属于医药技术领域，具体是涉及到一种特异识别人PLK1位点的sgRNA、质粒、纳米复合物和应用，所述sgRNA的序列为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3，采用本发明专利技术的sgRNA序列，基因编辑效率较高，持续时间长，包含上述sgRNA的质粒可以顺利的进入细胞核中发挥作用；脂质体iLP181具有合适的pKa值，较好的内涵体逃逸效果，较好的靶向性；得到的纳米复合物在体内外同时具有较好的安全性，有效的实现荷载核酸的逃逸与释放，且在长时间下依然具有较高的基因编辑效率，可以有效的抑制肿瘤细胞的增值。增值。增值。

【技术实现步骤摘要】
一种特异识别人PLK1位点的sgRNA、质粒、纳米复合物和应用


[0001]本专利技术属于医药
，具体是涉及到一种特异识别人PLK1位点的sgRNA、质粒、纳米复合物和应用。

技术介绍

[0002]Polo样激酶(polo
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like kinase1，PLK1)，是一种广泛存在于真核生物中的丝/苏氨酸蛋白激酶，因此在细胞周期中起重要作用而受到广泛关注。研究发现，PLK1在人类大多数肿瘤中高表达，并与肿瘤细胞的增殖及患者的预后密切相关。临床前期结果表明干扰PLK1的表达能够显著抑制包括非小细胞肺癌、淋巴瘤、结直肠癌在内的多种肿瘤的生长，且对正常细胞无显著影响。因此PLK1被认为是一个有良好应用前景的恶行肿瘤新靶点。因此利用基因编辑技术针对肿瘤内的PLK1靶点，揭示PLK1基因调控肿瘤增殖机制，将为人类PLK1位点相关的癌症治疗及药物的研发提供新思路，具有重要意义。
[0003]目前较为成熟的基因编辑技术包括：ZFN、TALEN与CRISPR/Cas基因编辑技术。虽然ZFN与TALEN基因打靶技术是目前研究较为成熟的两种定点突变技术，但是这两种技术构建程序较为复杂，每一个位点需要构建一对响应的核酸酶。而CRISPR/Cas基因编辑技术对特异识别的位点靠小的crRNA的引导来完成。每个特异识别的crRNA只有几十个碱基，整个载体较小。相对于ZFN和TALEN载体更加容易构建。
[0004]CRISPR/Cas是古细菌一种不断进化适应的免疫防御机制。目前CRISPR/Cas基因编辑技术的发展进入了一个充满希望的时代，为目前无法治愈的疾病提供了新的治疗方法。应用于治疗癌症、水疱性皮肤病、亨廷顿氏病、镰状细胞病(SCD)、HIV
‑
1感染，并建立携带改良基因组的特异性动物模型等。在一定程度上，CRISPR/Cas的出现反映了人类基因编辑技术的重大进展，为进一步了解基因功能、潜在的各种疾病的生物学或病理机制以及最终开发新的治疗方案提供了一个有效而强大的平台。
[0005]常用的CRISPR/Cas递送载体有病毒载体和非病毒载体。虽然腺病毒AAV和慢病毒广泛应用于临床研究，但70％人群体内已含有中和AAV的抗体，且具有潜在基因整合性和引发免疫反应的担忧。在非病毒递送载体中，脂质纳米颗粒(Lipid Nanoparticles,LNPs)是应用最广泛的mRNA载体，目前已上市的mRNA疫苗mRNA
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1273、BNT162b2，以及尚处于临床试验阶段的新冠病毒mRNA疫苗CVnCoV、ARCT
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021和ARCoV都使用的是LNPs递送载体。LNPs主要由可离子化脂质、磷脂、胆固醇和PEG脂质组成，其中可离子化脂质是LNP响应细胞微环境、从内涵体逃逸的关键脂质分子。研究表明，解离常数pKa在6.2
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6.5范围的可离子化脂质在正常生理环境(pH7.4)条件下不带电荷，而在溶酶体等微酸环境下带正电荷，通过质子海绵效应、胶体渗透压效应，有效促进荷载核酸的逃逸与释放。与阳离子脂质相比，可离子化脂质显然更有优势，因为后者容易在生理环境下与生物大分子结合带来安全性问题。Alnylam公司上市的siRNA药物Patisiran所使用的LNPs的关键组分是Dlin
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MC3
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DMA，其pKa＝6.44，Dlin
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MC3
‑
DMA的酸响应能力、有效性与安全性已得到验证。

技术实现思路

[0006]本专利技术要解决的技术问题是提供一种特异识别人PLK1位点的sgRNA、质粒、纳米复合物和应用。
[0007]本专利技术的内容包括一种特异识别人PLK1位点的sgRNA，所述sgRNA的序列为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3，优选为SEQ ID NO：2。SEQ ID NO：2是在SEQ ID NO：1的基础上在SEQ ID NO：1序列前添加一段酶切识别位点序列而成，SEQ ID NO：3是在SEQ ID NO：2的基础上在SEQ ID NO：2序列前添加一个稳定sgRNA序列的碱基G而成，。所述的sgRNA负责识别的靶片段序列为SEQ ID NO:12。
[0008]一种质粒，包括上述sgRNA。
[0009]一种纳米复合物，包括脂质体iLP181，和上述质粒；所述脂质体iLP181由关键脂质iLP181、磷脂、胆固醇和PEG
‑
脂质组成；关键脂质iLP181的结构式为：
[0010][0011]所述磷脂为包括选自下列至少之一：二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、磷脂酰胆碱(POPC)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二月桂酰磷脂酰胆碱(DLPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)和蛋黄卵磷脂(EPC)。
[0012]所述PEG
‑
脂质包括选自下列至少之一：二硬脂酰磷脂酰乙醇胺
‑
PEG(DSPE
‑
PEG)、二肉豆蔻基甘油(DMG
‑
PEG)和二甲基丙烯酸酯(DMA
‑
PEG)。
[0013]所述关键脂质、磷脂、胆固醇和PEG
‑
脂质的摩尔比为(25
‑
57):(1
‑
37):(25
‑
67):(0.1
‑
19)。
[0014]脂质体iLP181的制备方法为，将关键脂质、磷脂、胆固醇和PEG
‑
脂质溶于乙醇溶剂中，搅拌，加入到柠檬酸钠溶液，得到脂质体iLP181。
[0015]一种所述的sgRNA在基因编辑中的应用。
[0016]一种所述的sgRNA在制备治疗癌症药物中的应用。
[0017]本专利技术的有益效果是，采用本专利技术的sgRNA序列，基因编辑效率较高，发挥基因编辑持续时间长，包含上述sgRNA的质粒可以顺利的进入细胞核中发挥作用；脂质体iLP181具有合适的pKa值，较好的内涵体逃逸效果，较好的靶向性；得到的纳米复合物在体内外同时具有较好的安全性，有效的实现荷载核酸的逃逸与释放，且在长时间下依然具有较高的基因编辑效率，可以有效的抑制肿瘤细胞的增值。
附图说明
[0018]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0019]图1为本专利技术实施例中用到的脂质体iLP181中关键脂质的结构。
[0020]图2为本专利技术实施例中用到的关键脂质iLY1809的核磁氢谱。
[0021]图3A为本专利技术实施例中纳米复合物iLP181/psgPLK1的结构示意图；
[0022]图3B为纳米复合物iLP181/psgPLK1的粒径与电势。
[0023]图4A为纳米复合物iLP181/psgPLK1的细胞活力检测；
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种特异识别人PLK1位点的sgRNA，其特征是，所述sgRNA的序列为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3。2.一种质粒，其特征是，包括如权利要求1所述的sgRNA。3.一种纳米复合物，其特征是，包括脂质体iLP181，和如权利要求2所示的质粒；所述脂质体iLP181由关键脂质iLY1809、磷脂、胆固醇和PEG
‑
脂质组成；关键脂质iLY1809的结构式为：4.如权利要求3所述的纳米复合物，其特征是，所述磷脂包括二硬脂酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰乙醇胺、二月桂酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、蛋黄卵磷脂中的一个或多个。5.如权利要求3所述的纳米复合物，其特征是，所述PEG
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脂质包括二硬脂酰磷脂酰乙醇胺

【专利技术属性】
技术研发人员：黄渊余，翁郁华，李春辉，杨同仁，
申请(专利权)人：北京理工大学，
类型：发明
国别省市：