一种检测小分子物质的通用型适配体胶体金侧向层析试纸制造技术

本发明专利技术公开了一种检测小分子物质的通用型适配体胶体金侧向层析试纸，属于分析化学、医药、环境、食品安全检测和纳米生物传感等领域。将polyA

【技术实现步骤摘要】
一种检测小分子物质的通用型适配体胶体金侧向层析试纸


[0001]本专利技术涉及一种检测小分子物质的通用型适配体胶体金侧向层析试纸，属于分析化学、医药、环境、食品安全检测和纳米生物传感等领域。

技术介绍

[0002]侧流层析分析技术是一种基于纸张的检测平台，用于检测靶标，由于其在几分钟内提供结果的潜力引起研究者极大地兴趣。因为其具有低成本和易于开发生产的特点，侧流层析分析技术已被确定用于现场检测应用，并广泛应用于各种领域，包括生物医学、食品安全、质量控制以及环境卫生。侧流层析分析技术可以应用一系列生物样本，包括尿液、唾液、汗液、血清、血浆和血液。因此，提高了侧流层析分析技术的应用价值。侧流层析分析技术有两种模式，即竞争型和三明治型，对于低分子量的化合物(如真菌毒素等)通常采用的是竞争型。人工抗原和物种特异性抗免疫球蛋白抗体或适配体互补链和人工设计的核酸链通常喷洒在消化纤维素膜(NC)上分别作为T线和C线。T线的信号强度与分析物的浓度成反比。无论待检样本中是否含有检测目标物，C线都具有可见的独立信号。近年来，越来越多的研究人员重视通过侧流层析分析技术检测小分子物质，但是现有使用侧流层析分析技术对卡那霉素和OTA进行检测的研究寥寥无几，因此本文设计了一种检测小分子物质的通用型核酸适配体试纸条，对小分子物质，特别是卡那霉素和OTA进行检测。
[0003]核酸适配体是一种经过体外筛选技术
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指数富集的配体系统进化技术(Systematic evolution ofligands by exponential enrichment,SELEX)，得到的一小段结构化的寡核苷酸序列(RNA或DNA)，可以与相应的靶标分子(蛋白质，病毒，细菌，细胞，重金属离子等)进行高亲和力和强特异性的结合，为化学生物学界和生物医学界提供了一种新的高效快速识别的研究平台。
[0004]基于核酸适配体标记的胶体金侧向层析试纸，具有长期稳定、检测时间短、成本低、操作简单、快速等优点，是现场快速检测多种目标物的理想方法。现有核酸适配体胶体金侧向层析试纸条的设计，通常在T线上喷涂的是核酸链
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链霉亲和素复合物，随着检测目标物的改变，需要重新制备特定的复合物及喷涂制备硝酸纤维素膜，导致现有的侧向层析试纸条的通用型差。
[0005]目前，基于适配体识别卡那霉素或OTA的胶体金侧向层析试纸研究较少。在文献(Biosensors&Bioelectronics,2015,71(15):230
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242.)中，采用了DNA功能化的金纳米球(AuNPs
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DNA)作为探针，采用磁性微球(MMS)快速分离卡那霉素适配体的互补链(cDNA)，将cDNA作为检测目标，应用于试纸条上，根据cDNA的检测浓度转换为卡那霉素的检测浓度，以此来完成卡那霉素的定性以及定量检测，检测限达到4.96nmol/L(S/N＝3)。该试纸条需要借助MMS，且对卡那霉素的检测转化为对cDNA的检测，较为复杂，不利于产品的稳定生产和应用的重复性。
[0006]在文献(Journal ofChromatography B,2016,1022:102
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108.)中，开发了一种基于核酸适配体的侧向层析试纸条，该试纸条采用竞争结合模式，用于现场快速检测黄芪中
的OTA。竞争反应发生在固定在试纸条上的DNA探针(测试区)和样品中的靶标(OTA)之间，两者竞争结合AuNPs
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apt偶联物。该试纸条T线的颜色与样品中OTA的浓度成负相关。基于该方法，可在15min内完成OTA的检测，检测线为1ng/mL。该试纸条将适配体偶联到AuNPs上，不利于样品中OTA对适配体的竞争，产品稳定性差，且设计较为复杂通用性差。
[0007]目前，已开发的核酸适配体胶体金侧向层析试纸，针对某个特定的目标物，试纸条上的探针需要反复优化设计，通用性差，检测灵敏度有待提高。

技术实现思路

[0008][技术问题][0009]现有核酸适配体胶体金侧向层析试纸条的设计，通常在T线上喷涂的是链霉亲和素
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核酸链复合物，针对某个特定的检测目标物，需要重新制备链霉亲和素
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核酸链复合物，及重新喷涂制备硝酸纤维素膜，导致现有的侧向层析试纸条通用性不佳，试纸条的制备成本高。
[0010][技术方案][0011]本专利技术采用AuNPs@polyA
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DNA偶联物作为探针，该偶联物是采用polyA作为锚定块，将polyA
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DNA锚定在纳米金粒子上制备的。核酸试纸条的检测区域(T线)喷涂链霉亲和素，控制区域(C线)喷涂与AuNPs@polyA
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DNA偶联物的DNA部分互补的核酸链，构建了通用型的试纸条。该试纸条在T线喷涂的链霉亲和素，以及在C线喷涂的链霉亲和素
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核酸链复合物无需改变，仅改变polyA
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DNA上与适配体互补的部分，即可检测另一种物质，为以后的检测提供了方便。
[0012]本专利技术所使用的适配体，是在已报道的适配体核酸链的基础上增加5个T碱基，这5个核酸碱基用于辅助杂交。探针上有15个碱基与适配体核酸链互补。生物素化的适配体核酸链与探针结合后，探针才能进一步与T线上的链霉亲和素结合。当存在小分子物质时，小分子物质与探针竞争结合适配体核酸链，抑制了探针与适配体核酸链的杂交，从而抑制了T线的显色，实现了快速检测。
[0013]本专利技术提供的核酸适配体胶体金侧向层析试纸条的通用性体现在硝酸纤维素膜的制备和探针的设计上，即在制备针对不同的小分子物质的胶体金试纸条时，硝酸纤维素膜上的T线和C线无需变动，仅需变更小分子物质相应的核酸适配体和金标垫上的AuNPs@polyA
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DNA偶联物，针对不同的小分子物质，核酸适配体与探针中的polyA
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DNA与核酸适配体互补的片段做相应的变动。
[0014]本专利技术提供一种基于适配体和AuNPs@polyA
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DNA偶联物的通用型胶体金侧向层析试纸条检测卡那霉素，该试纸条一般是由样品垫、结合垫(金标垫)、硝酸纤维素膜(NC膜)、吸水垫和PVC胶板组成。
[0015]所述试纸条的检测原理为：采用竞争法检测小分子物质，当样品溶液中不含小分子物质时，5
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端生物素化的核酸适配体与AuNPs@polyA
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DNA探针结合，进而在T线上被链霉亲和素捕获形成AuNPs@polyA
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DNA
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Apt复合物，由于AuNPs的积累，在T线可以观察到一个清晰地深红色带，检测结果为阴性。当待测溶液中含有小分子物质时，小分子物质与5
’
端生物素化的核酸适配体结合，核酸适配体不能与AuNPs@polyA
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DNA探针结合，导致探针在T线区域的积累降低，T线较浅或不显本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种通用型胶体金侧向层析试纸条，其特征在于，含有核酸适配体、探针polyA
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DNA和链霉亲和素
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生物素
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DNAc；所述探针polyA
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DNA含有polyA片段、与DNAc互补的片段和与核酸适配体互补的片段；所述核酸适配体的5
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端经生物素标记；所述核酸适配体可与待测的小分子物质特异性结合。2.根据权利要求1所述的通用型胶体金侧向层析试纸条，其特征在于，所述链霉亲和素
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生物素
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DNAc是将链霉亲和素与5
’
端经生物素标记的DNAc等体积混合，在3～5℃孵育0.8～1.2h制备得到的；所述DNAc的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。3.根据权利要求2所述的通用型胶体金侧向层析试纸条，所述链霉亲和素浓度为2.5mg/mL，所述DNAc浓度为250μM。4.根据权利要求1所述的通用型胶体金侧向层析试纸条，其特征在于，所述小分子物质包括但不限于卡那霉素或OTA。5.根据权利要求1～4任一所述的通用型胶体金侧向层析试纸条，其特征在于，所述试纸条包括样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和PVC胶板；所述PVC底板上依次黏贴样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；所述NC膜上依次设有检测区和控制区，且检测区和控制区之间的距离为4～6mm；所述检测区上有链霉亲和素，控制区上有链霉亲...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭池方，常芮，李秀萍，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：