化学发光免疫分析技术中磁微粒活化效率的鉴定方法技术

本发明专利技术涉及免疫技术检测领域，特别涉及化学发光免疫分析技术中磁微粒活化效率的鉴定方法。包括：磁珠经活化后和未经活化的发光强度的检测，以及活化效率的鉴定；其中，磁珠经活化后发光强度的检测：磁珠与EDC、NHS反应，经清洗处理，得到活化后的磁珠；活化后的磁珠与生物素反应，反应产物与洗脱液震荡，得到磁微粒

Identification of magnetic particle activation efficiency in chemiluminescence immunoassay

【技术实现步骤摘要】
化学发光免疫分析技术中磁微粒活化效率的鉴定方法


[0001]本专利技术涉及免疫技术检测领域，特别涉及化学发光免疫分析技术中磁微粒活化效率的鉴定方法。

技术介绍

[0002]化学发光免疫分析(chemiluminescence immunoassay,CLIA)，是将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合，用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等的检测分析技术。是继放免分析、酶免分析、荧光免疫分析和时间分辨荧光免疫分析之后发展起来的一项最新免疫测定技术。它是用化学发光剂直接标记抗原或抗体的免疫分析方法。常用于标记的化学发光物质有吖啶酯类化合物，是有效的发光标记物，其通过起动发光试剂作用而发光，强烈的直接发光在一秒钟内完成，为快速的闪烁发光。吖啶酯作为标记物用于免疫分析，其化学反应简单、快速、无须催化剂；检测小分子抗原采用竞争法，大分子抗原则采用夹心法，非特异性结合少，本底低；与大分子的结合不会减小所产生的光量，从而增加灵敏度。
[0003]磁微粒化学发光免疫分析是将磁性分离技术、化学发光技术、免疫分析技术三者结合起来的一种新兴分析方法，该技术充分利用了磁性分离技术的快速易自动化性，化学发光技术的高灵敏度性，以及免疫分析的特异性，在生物分析领域展现了不可替代的作用。
[0004]磁珠种类包括羟基磁珠、羧基磁珠、氨基磁珠、环氧基磁珠、NHS磁珠、SA磁珠。羧基磁微粒EDC/NHS活化后产生琥珀酰亚胺酯中间体，其可与氨基标记物进行反应。现有技术中，可以通过直接或间接检测氨基标记物的含量来反映磁微粒的活化中间体含量，从而对活化效率进行评判。但当使用异鲁米诺或氨基化吖啶酯等疏水性小分子氨基标记物进行直接测定时，Merck磁微粒表面由于疏水及孔隙结构会造成小分子氨基标记物的大量吸附，且难以洗脱，从而造成本底较高，影响检测灵敏度。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术提供了一种化学发光免疫分析技术中磁微粒活化效率的鉴定方法。该方法通过使用亲水性的氨基生物素修饰性PEG(Biotin
‑
PEG
‑
NH2)与活化后磁珠反应，通过生物素链霉亲合素系统利用化学发光技术来间接鉴定活化位点的含量。
[0006]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0007]本专利技术提供了一种化学发光免疫分析技术中磁微粒活化效率的鉴定方法，包括以下步骤：
[0008]一、磁珠未经活化的发光强度的检测
[0009](1)将磁珠原液进行第一清洗处理4～6次，得到清洗后的磁珠；
[0010](2)清洗后的磁珠与生物素在室温条件下反应1～4h，反应产物与洗脱液在100～200prm、室温条件下震荡12～16h，封闭，得到磁微粒
‑
生物素；
[0011](3)将磁微粒
‑
生物素与链霉亲和素
‑
发光标记物反应10～30min，得到磁微粒
‑
发
光标记物复合物；
[0012](4)将磁微粒
‑
发光标记物复合物与化学发光底物反应5～15min，检测发光强度L1；
[0013]二、磁珠经活化后发光强度的检测
[0014](1)将磁珠原液与EDC、NHS在500～700prm、室温条件下反应1～2h，经第二清洗处理1～3次，得到活化后的磁珠；
[0015](2)活化后的磁珠与生物素在室温条件下反应1～4h，反应产物与洗脱液在100～200prm、室温条件下震荡12～16h，封闭，得到磁微粒
‑
生物素；
[0016](3)将磁微粒
‑
生物素与链霉亲和素
‑
发光标记物反应10～30min，得到磁微粒
‑
发光标记物复合物；
[0017](4)将磁微粒
‑
发光标记物复合物与化学发光底物反应5～15min，检测发光强度L2；
[0018]三、活化效率的鉴定
[0019]将发光强度L1、发光强度L2与生物素梯度样本浓度拟合定标曲线，然后采用四参数lin/log进行拟合，将发光强度带入拟合曲线，求出同一羧基磁珠上偶联的生物素含量，从而判断不同实验条件间活化效率的高低。
[0020]作为优选，链霉亲和素
‑
发光标记物为SA
‑
HRP或SA
‑
吖啶酯。
[0021]作为优选，生物素为Biotin
‑
PEG
‑
NH2。
[0022]作为优选，第一清洗处理所用洗涤缓冲液为PBS缓冲液或Tis
‑
HCl缓冲液；
[0023]PBS缓冲液的pH值为5.0～8.0，浓度为0.05M～0.1M；
[0024]Tis
‑
HCl缓冲液的pH值为7.0～9.0，浓度为0.05M～2M。
[0025]作为优选，第二清洗处理所用洗涤缓冲液为PBS缓冲液、醋酸/醋酸钠缓冲液、2
‑
(N
‑
马林)乙磺酸
‑
水合物缓冲液中的一种；
[0026]PBS缓冲液的pH值为5.0～8.0，浓度为0.05M～0.1M；
[0027]醋酸/醋酸钠缓冲液的pH值为4.0～9.0，浓度为0.05M～0.1M；
[0028]2‑
(N
‑
马林)乙磺酸
‑
水合物缓冲液的pH值为4.0～9.0，浓度为0.05M～0.1M。
[0029]作为优选，洗脱液选自吐温
‑
20缓冲液、Tritonx
‑
100缓冲液、SDS缓冲液、甘氨酸缓冲液、赖氨酸缓冲液、精氨酸缓冲液、盐酸胍缓冲液、尿素缓冲液中的一种；
[0030]作为优选，吐温
‑
20缓冲液的质量体积百分浓度为0.005％～5％；
[0031]作为优选，Tritonx
‑
100缓冲液的质量体积百分浓度为0.005％～5％；
[0032]作为优选，SDS缓冲液的质量体积百分浓度为0.005％～5％；
[0033]作为优选，甘氨酸缓冲液的质量体积百分浓度为5％～20％；
[0034]作为优选，赖氨酸缓冲液的质量体积百分浓度为5％～20％；
[0035]作为优选，精氨酸缓冲液的质量体积百分浓度为5％～20％；
[0036]作为优选，盐酸胍缓冲液的质量体积百分浓度为5％～20％；
[0037]作为优选，尿素缓冲液的质量体积百分浓度为5％～20％。
[0038]本专利技术提供了一种化学发光免疫分析技术中磁微粒活化效率的鉴定方法。包括：磁珠经活化后和未经活化的发光强度的检测，以及活化效率的鉴定；其中，磁珠经活化后发光强度的检测：磁珠与EDC、NHS反应，经清洗处理，得到活化后的磁珠；活化后的磁珠与生物本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种化学发光免疫分析技术中磁微粒活化效率的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：一、磁珠未经活化的发光强度的检测(1)将磁珠原液进行第一清洗处理4～6次，得到清洗后的磁珠；(2)清洗后的磁珠与生物素在室温条件下反应1～4h，反应产物与洗脱液在100～200prm、室温条件下震荡12～16h，封闭，得到磁微粒
‑
生物素；(3)将磁微粒
‑
生物素与链霉亲和素
‑
发光标记物反应10～30min，得到磁微粒
‑
发光标记物复合物；(4)将磁微粒
‑
发光标记物复合物与化学发光底物反应5～15min，检测发光强度L1；二、磁珠经活化后发光强度的检测(1)将磁珠原液与EDC、NHS在500～700prm、室温条件下反应1～2h，经第二清洗处理1～3次，得到活化后的磁珠；(2)活化后的磁珠与生物素在室温条件下反应1～4h，反应产物与洗脱液在100～200prm、室温条件下震荡12～16h，封闭，得到磁微粒
‑
生物素；(3)将磁微粒
‑
生物素与链霉亲和素
‑
发光标记物反应10～30min，得到磁微粒
‑
发光标记物复合物；(4)将磁微粒
‑
发光标记物复合物与化学发光底物反应5～15min，检测发光强度L2；三、活化效率的鉴定将发光强度L1、发光强度L2与生物素梯度样本浓度拟合定标曲线，然后采用四参数lin/log进行拟合，将发光强度带入拟合曲线，求出同一羧基磁珠上偶联的生物素含量，从而判断不同实验条件间活化效率的高低。2.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于，所述链霉亲和素
‑
发光标记物为SA
‑
HRP或SA
‑
吖啶酯；生物素为Biotin
...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯志山，王慧敏，李冰，王玉堂，李林，
申请(专利权)人：郑州安图生物工程股份有限公司，
类型：发明
国别省市：