具有经修饰的CH2-CH3序列的犬抗体制造技术

本发明专利技术公开了具有特定属性的具有经修饰的CH2

【技术实现步骤摘要】
具有经修饰的CH2
‑
CH3序列的犬抗体
[0001]本申请是申请日为2014年12月19日的中国专利申请201480075969.3
ꢀ“
具有经修饰的CH2
‑
CH3序列的犬抗体”的分案申请。
[0002]相关申请的交叉引用本申请要求享有于2014年7月30日提交的美国临时申请系列号62/030,812、于2013年12月20日提交的美国临时申请系列号61/918,847和于2014年12月20日提交的美国临时申请系列号61/918,946的权益，上述所有文件的内容通过引用以其整体并入本文。


[0003]本专利技术涉及具有特定属性的犬化抗体。本专利技术也涉及针对犬PD
‑
1的犬化抗体，其具有特定序列并对犬PD
‑
1具有高结合亲和力。本专利技术还涉及本专利技术的抗体在治疗狗（包括癌症治疗）上的用途。

技术介绍

[0004]犬抗体（也称为免疫球蛋白G或IgG）是约150 Kd的大四聚体蛋白质。每个IgG蛋白质由两条相同的、各约25 Kd的轻链和两条相同的、各约50 Kd的重链构成。犬IgG有四个已知的IgG重链亚类，且其分别被称为IgGA、IgGB、IgGC和IgGD表示。轻链有两个类型：κ和λ链。每一条κ或λ轻链均由一个可变域（VL）和一个恒定域（CL）构成。两条重链中的每一条均由一个可变域（VH）和三个恒定域（称为CH
‑
1、CH
‑
2和CH
‑
3）组成。CH
‑
1域通过称为“铰链”或作为另一种叫法“铰链区”的氨基酸序列连接至CH
‑
2域。在人类中，IgG以四个被称为IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的亚类中的一类而存在。IgG的亚类很大程度上由铰链区的序列所确定，该序列在IgG的四个亚类中彼此不同。两条重链通过二硫键彼此连接，并且每条重链也通过二硫键连接至轻链中的一条。
[0005]用木瓜蛋白酶消化IgG抗体使抗体分子在铰链区断裂而导致形成三个片段。这些片段中的两个是相同的并且各自由与重链的VH和CH1域维系在一起的轻链组成。这些片段被称为“Fab”片段，并且其含有抗体的抗原结合位点。用木瓜蛋白酶消化所得的第三个片段被称为“Fc”，并且其含有通过二硫键维系在一起的两条重链的剩余部分。Fc因而含有由两条重链各自的CH2和CH3域所组成的二聚体。Fab使得抗体能够结合其同源表位，而Fc使得抗体能够介导免疫效应器功能如抗体依赖性细胞毒性（ADCC）、抗体依赖性吞噬作用（ADCP）和补体依赖性细胞毒性（CDC）。
[0006]本领域熟知，IgG抗体通过使其Fc部分结合至一族被称为Fc
γ
受体的蛋白质来介导效应器功能如ADCC和ADCP，而CDC则是通过使Fc结合至补体的第一组分，C1q，来介导的。本领域还熟知，不同的IgG亚类在其介导这些效应器功能的能力上有所不同。例如，人类IgG1显示出强ADCC和CDC，而IgG4则显示出弱乃至无ADCC和CDC。另外，用于识别哪个IgG亚类显示出或缺乏效应器功能的方法是本领域熟知的。
[0007]用于治疗目的的依赖单克隆抗体的方法需要设计相称的抗体或抗体片段以实现所需的治疗响应。例如，一些癌症治疗方法需要治疗抗体具有增强的效应器功能，而其它的
Res. 13: 2151
‑
2157. (2007)] 。更惊人的是，在肿瘤细胞上的PD
‑
配体表达已经与跨多个肿瘤类型的人癌症患者的不良预后相关联[综述在Okazaki和Honjo, Int. Immunol. 19: 813
‑
824 (2007)] 。
[0012]此外，Nomi 等人[Clin. Cancer Res. 13: 2151
‑
2157 (2007)]证实了通过施用PD
‑
1或PD
‑
L1指导的抗体在侵袭性胰腺癌的鼠模型中阻断PD
‑
L1与PD
‑
1的结合的治疗效果。这些抗体会有效地促进肿瘤反应性的CD8+ T细胞向肿瘤中的渗透，从而导致抗肿瘤效应物（包括IFN
‑
γ、颗粒蛋白酶B和穿孔蛋白）的上调。类似地，抗体用于阻断PD
‑
L1和PD
‑
1的结合的用途，会在小鼠鳞状细胞癌模型中显著地抑制肿瘤生长[Tsushima 等人,Oral Oncol. 42: 268
‑
274 (2006)] 。
[0013]在其它研究中，用PD
‑
L1对鼠肥大细胞瘤系的转染导致当与肿瘤特异性的CTL克隆共培养时减少的肿瘤细胞裂解。当加入抗
‑
PD
‑
L1单克隆抗体时，裂解被恢复[Iwai 等人,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99: 12293
‑
12297 (2002)]。在体内，显示了阻断PD
‑
1/PD
‑
L1相互作用会增加继承性T细胞转移疗法在小鼠肿瘤模型中的效力[Strome 等人, Cancer Res. 63: 6501
‑
6505 (2003)] 。关于PD
‑
1在癌症治疗中的作用的其它证据来自用PD
‑
1敲除的小鼠执行的实验，其中表达PD
‑
L1的骨髓瘤细胞仅在野生型动物中生长(导致肿瘤生长和有关的动物死亡)，但是不在PD
‑
1缺陷型小鼠中生长[Iwai Y. 等人, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99: 12293
‑
12297 (2002)] 。近年来，针对PD
‑
1的抗体(包括针对人PD
‑
1的人源化鼠单克隆抗体)已经至少在人类的癌症治疗中显示了初步成功[参见例如，US 8,354,509 B2、US 8,008,449 B2和US 7,595,048 B2]。
[0014]抗
‑
PD
‑
1抗体还可以用在慢性病毒感染中。在急性病毒感染以后产生的记忆性CD8+ T细胞是高度功能性的，并且构成保护性免疫的一个重要组分。相反，慢性感染经常特征在于病毒特异性的T
‑
细胞应答的不同程度的功能缺损(耗竭)，并且该缺陷是宿主不能消除持久病原体的一个主要原因。尽管功能性的效应T细胞最初在感染的早期阶段产生，它们在慢性感染的进程中逐渐丧失功能。Barber 等人[Nature 439: 682
‑
687 (2006)]证实，用LCMV的实验室毒株感染的小鼠发展了慢性感染，导致血液和其它组织中的高病毒水平。这些小鼠最初形成了稳健的T细胞应答，但是最终在T细胞耗竭后屈服于感染。Barber 等人发现，通过注射阻断PD
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.基因修饰的犬可结晶片段区(cFc区)的变体或包含修饰的cFc区的犬化抗体；其中所述cFc区的变体包含与选自SEQ ID NO:130和SEQ ID NO:132的基因修饰的cFc区的氨基酸序列具有95%或更高同一性的氨基酸序列；其中D31A和N63A被保持在所述修饰的cFc区的变体中，条件是具体排除包含与选自SEQ ID NO:130和SEQ ID NO:132的基因修饰的cFc区的氨基酸序列具有100%同一性的氨基酸序列且其中D31A和N63A被保持的所述cFc区的变体。2.权利要求1的修饰的cFc区的变体或包含所述修饰的cFc区的变体的犬化抗体，其中含有三个额外的氨基酸取代：P4A、A93G和P95A，由此含有以下五个取代：P4A、D31A、N63A、A93G和P95A。3.权利要求1或2的犬化抗体，其中所述犬化抗体特异性结合犬程序性死亡受体1 (犬PD
‑
1)。4.权利要求3的犬化抗体，其中所述cFc区进一步包含铰链区，所述铰链区包含选自SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:111和SEQ ID NO:112的氨基酸序列。5.权利要求3的犬化抗体，所述犬化抗体进一步包含由SEQ ID NO:29的氨基酸序列组成的重链互补决定区1 (VH CDR1)；由SEQ ID NO:33的氨基酸序列组成的重链互补决定区2 (VH CDR2)；由SEQ ID NO:38的氨基酸序列组成的重链互补决定区3 (VH CDR3)；由SEQ ID NO:15的氨基酸序列组成的轻链互补决定区1 (VL CDR1)；由SEQ ID NO:18的氨基酸序列组成的轻链互补决定区2 (VL CDR2)；和由SEQ ID NO:24的氨基酸序列组成的轻链互补决定区3(VL CDR3)；或者所述犬化抗体进一步包含由SEQ ID NO:27的氨基酸序列组成的重链互补决定区1 (VH CDR1)；由SEQ ID NO:31的氨基酸序列组成的重链互补决定区2 (VH CDR2)；由SEQ ID NO:36的氨基酸序列组成的重链互补决定区3 (VH CDR3)；由SEQ ID NO:13的氨基酸序列组成的轻链互补决定区1 (VL CDR1)；由SEQ ID NO:19的氨基酸序列组成的轻链互补决定区2 (VL CDR2)；和由SEQ ID NO:25的氨基酸序列组成的轻链互补决定区3 (VL CDR3)；或者所述犬化抗体进一步包含由SEQ ID NO:28的氨基酸序列组成的重链互补决定区1 (VH CDR1)；由SEQ ID NO:32的氨基酸序列组成的重链互补决定区2 (VH CDR2)；由SEQ ID NO:37的氨基酸序列组成的重链互补决定区...

【专利技术属性】
技术研发人员：M莫塞，张远征，I塔佩伊，
申请(专利权)人：英特维特国际股份有限公司，
类型：发明
国别省市：