一种铂壳金核纳米酶介导的磁弛豫传感信号放大系统的构建方法及其应用技术方案

本发明专利技术属于生化分析技术领域。具体涉及一种铂壳金核纳米酶介导的磁弛豫传感信号放大系统的构建方法及其应用。所述生物传感器为利用微波合成法合成金纳米颗粒，并以其为核心，通过抗坏血酸与氯铂酸之间的氧化还原反应在金纳米颗粒表面铂沉，制备了Pt@AuNPs纳米酶，以Pt@AuNPs纳米酶为信号放大器，以过氧化氢介导的顺磁离子的价态转化传感体系为磁弛豫信号读出系统，分别构建Pt@AuNPs纳米酶介导的磁弛豫免疫传感器和磁弛豫DNA传感器，用于细菌感染标志物及食源性致病菌的快速高灵敏检测。感染标志物及食源性致病菌的快速高灵敏检测。感染标志物及食源性致病菌的快速高灵敏检测。

【技术实现步骤摘要】
一种铂壳金核纳米酶介导的磁弛豫传感信号放大系统的构建方法及其应用


[0001]本专利技术涉及资源和环保
，具体涉及一种铂壳金核纳米酶介导的磁弛豫传感信号放大系统的构建方法及其应用。

技术介绍

[0002]近年来，食品安全问题层出不穷，对我国及世界人民造成了严重的健康威胁和经济损失，2003年世界卫生组织将食品安全列为全球公共卫生十大威胁之一。食源性致病菌引起的食源性疾病是最为突出的食品安全问题之一，占全球食品安全事件总数的45%以上。根据《中国卫生健康统计年鉴》统计数据，2015~2018年我国因食源性致病菌患病的人数占所有食源性患病人数的29.3%。同时，全世界每年大约有6亿人食源性致病菌而感染食源性疾病，更有大约42万的人因此失去宝贵的生命。其中沙门氏菌和单增李斯特菌时最受关注的两种食源性致病菌。沙门氏菌有水条件下可以存活2~3周、动物粪便中可存货活1~2月、在食品基质中可存活数月之久。据美国疾病控制和预防中心（CDC）估计，美国每年至少有100万例食源性疾病是由沙门氏菌引起的，导致超过19,000例住院治疗和约380例死亡，可引发恶心、呕吐、腹泻等症状，尤其对于老人、幼童、孕妇等免疫力低下者极易感染，可引起呼吸急促、发热、脑膜炎甚至死亡，具有传播媒介多、途径广的特点。单增李斯特菌（L.monocytogenes）是一种兼性厌氧型革兰氏阳性菌，能够在0.4℃~37℃温度范围内生长繁殖，且具有很强的环境适应能力，广泛存在于动物体内、各种食物中、土壤、水源等环境里，能够通过粪
‑
口传播、进食传播、眼及破损皮肤传播、黏膜传播等多种传播途径让人畜染病。感染者会出现脑膜炎、脑炎、心肌炎等症状，孕妇感染时可能会出现流产、胎儿畸形等不良症状。基于其强危害性，2000年，单增李斯特菌就被列为重点检测对象，世界卫生组织更是将其列为四大必须检测的食源性致病菌之一。因此，为了有效地控制和消除食源性致病菌对人类健康的危害，亟需建立一种灵敏、快速、有效的食源性致病菌检测方法，为全人类的身体健康提供保障。
[0003]目前食源性致病菌检测方法主要包括常规检测技术、免疫学检测技术、分子生物学检测技术及生物传感技术等。常规检测技术主要是对微生物及其生化成分进行准确识别，如分离培养法通过微生物在特定的培养基上呈现出特定的生长、形态和生理生化特征来判定特定微生物的种类和数量。具有检出限低、准确性高的优点。但对于未知菌种该方法效果有限，且该方法耗时长、操作复杂、对操作人员要求高、成本昂贵的弊端，无法实现对食源性致病菌进行现场快速及时检测的目的。免疫学分析法主要是基于抗体和抗原之间的高亲和力相互作用，包括酶联免疫吸附测定法和胶体金免疫层析试纸条。酶联免疫吸附测定法是目前比较成熟的免疫检测技术，因其成本低和特异性高而被广泛使用。然而，它也具有相关的局限性，包括多个洗涤步骤，因蛋白质的变性会产生一些假阴性，并且与相似但非目标蛋白质的交叉反应而存在假阳性的风险。胶体金免疫层析试纸条具有操作简单、反应速度快、适合现场快速检测等优点，但其灵敏度比酶联免疫吸附测定法低，线性范围较窄。随
着生物技术的发展，分子生物学技术逐渐应用于食品安全检测领域。首先建立用于鉴定动物来源肉制品的聚合酶链式反应方法，基于聚合酶链式反应的DNA分析因其简单、快速、特异性强等优点而越来越多地应用于食品分析领域，聚合酶链式反应方法已逐渐成为主要方法。但是，昂贵的仪器和熟练操作人员的需求限制了它们的广泛使用。尽管这些方法灵敏，成本效益高并且可以提供所调查微生物的定性和定量信息，但它们测定时间的长在即使检测应用上受限。
[0004]血清中的降钙素原（PCT）是一种具有良好特异性的细菌感染生物标志物，正常的人体中降钙素原的含量很低，只有当人体被细菌感染之后其在血液中的浓度才会显著上升，因此其被广泛作为一种细菌感染的生物标志物，对血清中痕量的降钙素原进行高灵敏检测，对及时诊断细菌性感染等疾病、维护人体健康具有重要意义。
[0005]生物传感器具有选择性好，灵敏度高，自动化程度高，便携方便，在食品安全、体外诊断等领域中发挥了越来越重要的作用。随着纳米材料的发展，基于超顺磁纳米颗粒的磁弛豫生物传感器受到了广泛的关注。经典的磁弛豫(magnetic relaxation switching，MRS)生物传感器是基于超顺磁纳米颗粒(magnetic particles, MNPs)在水溶液中的状态（分散或聚集）发生变化，导致其局部磁场均匀性发生改变，形成非均匀局部磁场，进而引起周围水分子质子横向弛豫时间(transverse relaxation time, T2)发生显著改变。但目标只能结合有限数量的MNPs，缺乏足够宽的线性范围和足够强的磁信号探针，且由于MNPs的数量和状态改变容易受到样品基质等多因素的干扰，产生非特异性聚集，导致方法的稳定性较差。

技术实现思路

[0006]为解决上述技术问题，本专利技术提供一种铂壳金核纳米酶介导的磁弛豫传感信号放大系统的构建方法及其应用。
[0007]本专利技术提供所采用的技术方案是：首先利用微波合成法合成金纳米颗粒，并以其为核心，通过抗坏血酸与氯铂酸之间的氧化还原反应在金纳米颗粒表面铂沉，制备了Pt@AuNPs纳米酶。在此基础上，将Pt@AuNPs纳米酶有机嵌入磁弛豫生物传感技术，用于细菌感染标志物及食源性致病菌的快速检测。主要原理（图1）如下：分别在磁珠和Pt@AuNPs纳米酶表面偶联捕获生物识别分子和检测生物识别分子，得到“磁珠
‑
捕获识别分子”和“Pt@AuNPs纳米酶
‑
检测识别分子”。在目标物存在的情况下，三者可特异性的形成“双抗夹心”结构，从而得到“磁珠
‑
目标物
‑
Pt@AuNPs纳米酶”。“磁珠
‑
目标物
‑ꢀ
Pt@AuNPs纳米酶”可用于降解过氧化氢，降解量与Pt@AuNPs纳米酶和目标物含量成正相关，降解完成后，剩余的过氧化氢可用于MnO4‑
/Mn
2+
的价态转化，因MnO4‑
无磁信号，而Mn
2+
具有很强的磁信号，因此可通过过氧化氢还原MnO4‑
生成Mn
2+
而实现磁信号改变。磁信号改变量与剩余过氧化氢含量成负相关，因此，磁信号改变量与目标物含量成正相关。具体地，一种铂壳金核纳米酶介导的磁弛豫传感信号放大系统的构建方法，所述生物传感器为利用微波合成法合成金纳米颗粒，并以其为核心，通过抗坏血酸与氯铂酸之间的氧化还原反应在金纳米颗粒表面铂沉，制备了Pt@AuNPs纳米酶，以Pt@AuNPs纳米酶为信号放大器，以过氧化氢介导的顺磁离子的价态转化传感体系为磁弛豫信号读出系统，分别构建Pt@AuNPs纳米酶介导的磁弛豫免疫传感器和磁弛豫DNA传感器，用于细菌感染标志
物及食源性致病菌的快速高灵敏检测。
[0008]一种铂壳金核纳米酶介导的磁弛豫传感信号放大系统的构建方法，所述生物传感器为利用微波合成法合成金纳米本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种铂壳金核纳米酶介导的磁弛豫传感信号放大系统的构建方法，其特征在于，所述生物传感器为利用微波合成法合成金纳米颗粒，并以其为核心，通过抗坏血酸与氯铂酸之间的氧化还原反应在金纳米颗粒表面铂沉，制备了Pt@AuNPs纳米酶，以Pt@AuNPs纳米酶为信号放大器，以过氧化氢介导的顺磁离子的价态转化传感体系为磁弛豫信号读出系统，分别构建Pt@AuNPs纳米酶介导的磁弛豫免疫传感器和磁弛豫DNA传感器，用于细菌感染标志物及食源性致病菌的快速高灵敏检测。2.根据权利要求1中所述的构建方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：S1：利用微波合成法合成粒径为13
‑
20nm的金纳米颗粒，并以其为核心，通过抗坏血酸与氯铂酸之间的氧化还原反应在金纳米颗粒表面铂沉，制备了Pt@AuNPs纳米酶；S2：将Pt@AuNPs纳米酶有机嵌入磁弛豫生物传感器，以Pt@AuNPs纳米酶为信号放大器，以过氧化氢介导的顺磁离子的价态转化传感体系为磁弛豫信号读出系统，以免疫分析和DNA杂交技术作为特异性识别系统，结合磁分离，分别构建Pt@AuNPs纳米酶介导的磁弛豫免疫传感器和磁弛豫DNA传感器。3.根据权利要求2中所述的构建方法，其特征在于，所述步骤S1具体操作包括如下：1）将HAuCl4和超纯水中加入反应釜中，在微波加热下，保持沸腾；然后开启磁力搅拌，一次性迅速加入柠檬酸钠，磁力搅拌反应，随后冷却至室温，得到AuNPs；2）Pt@AuNPs的制备：将AuNP与超纯水混合，加入聚乙烯吡咯烷酮，之后将该溶液在涡流旋转振荡仪上旋涡震荡并温育，使聚乙烯吡咯烷酮包覆并稳定AuNP；然后将L
‑
抗坏血酸和氯铂酸水合物，加入混合物中混合，并立即孵育直至溶液的颜色从红色变为棕色/黑色，得到Pt@AuNPs悬浮液，将制备的Pt@AuNPs悬浮液冷却至室温，并洗涤循环去除多余的试剂，然后重悬于超纯水中，得到Pt@AuNPs。4.根据权利要求2中所述的构建方法，其特征在于，所述步骤S2中磁弛豫免疫传感器具体操作包括如下：a）MNPs
‑
降钙素原捕获抗体（MNP
S
‑
Ab1）偶联物的制备：取MNP
S
于的离心管中，将其放在磁分离架上，用MEST洗涤两次后置于磁分离架上分离；去除上清液，在离心管中加入EDC和NHS；随后在涡流振荡器中摇动混合物；然后将管放置在磁分离架上进行分离，再用MEST清洗两次并重悬，然后在管内加入Ab1，用PBST调节体积至，混合物在涡流振荡器中轻轻摇动；经磁分离和上清液去除后，将含1wt%BSA的PBST加入MNP
s
‑
Ab1偶联物中，在37℃条件下放置以封闭残基，磁分离后，用PBST清洗3
‑
5次，得到MNPs
‑
Ab1偶联物；b）Pt@AuNPs
‑
降钙素原检测抗体（Pt@AuNPs
‑
Ab2）偶联物的制备：用NaOH溶液将Pt@AuNPs悬浮液的pH调节至8
‑
9，加入Ab2，并用涡流旋转振荡仪在4
°
C下轻轻摇动反应；然后将含有BSA的PBS加入混合物中，孵育，以封闭Pt@AuNPs上的残留位点，通过离心收集得到Pt@AuNPs
‑
Ab2偶联物，将其分散到含有BSA和吐温
‑
20的PBS中，于4
°
C中储存以备后用；c）Pt@AuNPs介导的磁弛豫免疫传感器的构建：取MNP
s
‑
Ab1和降钙素原于离心管中，涡旋，磁分离除上清，用PBST洗涤，加入Pt@AuNPs
‑
Ab2，用PBS将体积补足后涡旋，磁分离，用PBST洗涤除去未反应的Pt@AuNPs
‑
Ab2，之后加入H2O2反应，磁分离，得到Pt@AuNPs纳米酶介导的磁弛豫免疫传感器。5.根据权利要求4中所述的构建方法，其特征在于，所述步骤a）中，在2mgMNPs表面偶联Ab1的偶联量为25
‑
50 ug，MNPs
‑
Ab1偶联物的浓度为50
‑
100μg/mL。<...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈翊平，吴紫荆，董永贞，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：