一种利用多色荧光内标动态校正DNA荧光光谱的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用多色荧光内标动态校正DNA荧光光谱的方法，包括如下步骤：确定待检测的STR基因座，并规划STR基因座中各个荧光颜色通道的排布；设计多色荧光内标；在每一次DNA片段检测分析时，识别前期嵌入的多色荧光内标，动态构建相应的光谱校正矩阵，进行DNA荧光光谱的校正。利用本发明专利技术，不需要专门配备光谱校正试剂和独立设置的光谱校正环节，DNA检测技术人员无需关注光谱校正矩阵和试剂盒的对应，也不需要关注何时光谱校正失真需要重做等繁琐问题，显著降低了STR检测技术的应用复杂度，也无疑可以降低检测成本，具有良好的潜在经济效益和重要的应用价值。在经济效益和重要的应用价值。在经济效益和重要的应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种利用多色荧光内标动态校正DNA荧光光谱的方法


[0001]本专利技术涉及一种校正DNA荧光光谱的方法，尤其涉及一种利用多色荧光内标动态校正DNA荧光光谱的方法，属于遗传物质检测


技术介绍

[0002]第一代DNA测序技术包括1975年由Frederick Sanger提出的链终止法以及1977年由Walter Gibert所专利技术的链降解法。其中，链终止法也称为Sanger法，其核心原理是：利用ddNTP的2
’
和3
’
基团都不含羟基，其在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键，因此可以用来中断DNA合成反应。在4个DNA合成反应体系中，分别加入一定比例带有放射性同位素标记的ddNTP(分别为：ddATP、ddCTP、ddGTP和ddTTP)，通过凝胶电泳和放射自显影后可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列。该方法的检测结果准确性高达99.999％，在行业内被认为是“金标准”；在司法鉴定、刑侦判定和遗传物质鉴定(基因诊断)等工作中发挥了重要作用。
[0003]STR(Short Tandem Repeat，短串联重复序列)是基因组中由2～6个碱基单元组成，重复串联的一类DNA重复序列。由于STR基因座的多态性丰富、突变率低，是DNA分型的金标准。如图1所示，在现有的STR检测操作流程中，通常使用单一颜色的荧光染料进行标记。由十几个已知碱基对(base pair，简写为bp)长度的DNA片段组成检验尺度(即内标DNA片段，简写为内标)，用来标定待测DNA片段长度。在实际电泳过程中，通过检测该颜色的内标特征峰，记录每个内标DNA片段出现的数据帧位置，可以建立数据帧位置和DNA片段长度的映射关系，用于电泳中待测DNA片段(STR基因片段)的长度计算。
[0004]在专利号为ZL 201110160549.3的中国专利技术专利中，公开了一种基于空间校正及光谱校正的毛细管阵列电泳检测方法。该方法将STR检测操作流程分为空间校正、光谱校正和DNA片段分析三个环节，其中在光谱校正环节中，先用n种荧光染料标记物在面阵CCD上成像，获得光谱校正矩阵，然后在DNA片段分析环节中，应用之前光谱校正环节获得的光谱校正矩阵进行内标以及DNA片段光谱数据的处理，获得DNA片段信息。但是，上述检测方法仍然存在以下不足：1)需要光谱校正试剂和独立的光谱校正环节；2)光谱校正矩阵是之前建立的，随时间推移，可能不再适用当前DNA片段检测；3)移动机器、更换毛细管等操作后都需要单独做一遍光谱校正；4)试剂盒种类较多时，各种荧光染料标记的光谱校正选择、应用容易混淆。

技术实现思路

[0005]本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种利用多色荧光内标动态校正DNA荧光光谱的方法。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术采用下述的技术方案：
[0007]一种利用多色荧光内标动态校正DNA荧光光谱的方法，包括如下步骤：
[0008](1)确定待检测的STR基因座，并规划所述STR基因座中各个荧光颜色通道的排布；
[0009](2)设计多色荧光内标；
[0010](3)在每一次DNA片段检测分析时，识别前期嵌入的所述多色荧光内标，动态构建相应的光谱校正矩阵，进行DNA荧光光谱的校正。
[0011]其中较优地，所述步骤(2)中，在预定间距的内标片段序列标记上不同颜色的荧光染料，得到所述多色荧光内标。
[0012]其中较优地，所述预定间距为彼此相等的间距。
[0013]其中较优地，所述多色荧光内标中，不同颜色标记的内标片段避免和待检测的STR基因座的bp段相近或重叠。
[0014]其中较优地，不同颜色标记的内标片段与待检测的STR基因座的bp段相距在10bp以上。
[0015]其中较优地，不同颜色标记的内标片段，彼此之间相距2bp以上。
[0016]其中较优地，不同颜色标记的内标片段所对应的DNA片段在50～100bp之间。
[0017]其中较优地，所述步骤(3)中，实时采集荧光光谱，直至检测到多个相等间距的原始荧光光谱峰，据此判断已采集到所述多色荧光内标；计算多色荧光染料的光谱分布，动态构建相应的光谱校正矩阵。
[0018]其中较优地，利用所述光谱校正矩阵对之前的原始荧光光谱进行回溯解谱，并评估实际解谱质量。
[0019]其中较优地，如果满足质量要求，继续用所述光谱校正矩阵实时处理后续的DNA片段的荧光光谱数据，以解析获得各个荧光颜色通道的待检DNA片段的谱峰，进而生成预定格式的数据文件，实现STR分型检测。
[0020]与现有技术相比较，本专利技术所提供的方法根据待测DNA片段的情况，选择内标嵌入多色荧光染料片段，形成一种新的多色荧光内标。在随后的每一次DNA片段检测分析环节中，自动识别前期嵌入的多色荧光内标，建立相应的光谱校正矩阵，并进行光谱校正运算，分析待测DNA片段。在本专利技术中，不需要专门配备光谱校正试剂和独立设置的光谱校正环节，DNA检测技术人员无需关注光谱校正矩阵和试剂盒的对应，也不需要关注何时光谱校正失真需要重做等繁琐问题，显著降低了STR检测技术的应用复杂度，也无疑可以降低检测成本，具有良好的潜在经济效益和重要的应用价值。
附图说明
[0021]图1为现有技术中，常用的单色荧光内标示例图；
[0022]图2为本专利技术所提供的多色荧光内标的示例图；
[0023]图3为本专利技术所提供的利用多色荧光内标动态校正DNA荧光光谱的方法流程图；
[0024]图4为本专利技术实施例中，待检测的STR基因座的荧光颜色通道排布示例图；
[0025]图5为本专利技术实施例中，设计好的多色荧光内标示例图；
[0026]图6为本专利技术所提供的方法中，动态构建光谱校正矩阵进行DNA荧光光谱解析的流程图；
[0027]图7为本专利技术实施例中，基于多色荧光内标构建的光谱校正矩阵示例图；
[0028]图8为本专利技术实施例中，原始荧光光谱的示例图；
[0029]图9为本专利技术实施例中，实际解谱后的STR基因片段光谱示例图。
具体实施方式
[0030]下面结合附图和具体实施例对本专利技术的
技术实现思路
做进一步的详细说明。
[0031]目前，业内广泛使用美国应用生物系统(Applied Biosystems)公司出品的3130/3130xl系列基因测序仪进行DNA测序或者片段分析。该类基因测序仪可以采用多种颜色(通常为四色或五色)的荧光对DNA片段进行标记。由于多色荧光检测的本质是检测多种颜色的荧光素在其中心发射波长处的信号。每一种荧光素发射光谱不是锐线光谱，而是有一定宽度分布的光谱带。一个纯色荧光除了在它自己的光谱中心波长处能采集到信号外，在其他荧光信号光谱的中心波长处也能检测到信号，从而形成信号重叠。为了校准该信号重叠，需要知道该荧光信号在其他荧光信号处产生的重叠系数。然后，在不同长度的DNA片段上分别标记不同颜色的荧光素并计数其系数，得到N
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用多色荧光内标动态校正DNA荧光光谱的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)确定待检测的STR基因座，并规划所述STR基因座中各个荧光颜色通道的排布；(2)设计多色荧光内标；(3)在每一次DNA片段检测分析时，识别前期嵌入的所述多色荧光内标，动态构建相应的光谱校正矩阵，进行DNA荧光光谱的校正。2.如权利要求1所述利用多色荧光内标动态校正DNA荧光光谱的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，在预定间距的内标片段序列标记上不同颜色的荧光染料，得到所述多色荧光内标。3.如权利要求2所述利用多色荧光内标动态校正DNA荧光光谱的方法，其特征在于：所述预定间距为彼此相等的间距。4.如权利要求2所述利用多色荧光内标动态校正DNA荧光光谱的方法，其特征在于：所述多色荧光内标中，不同颜色标记的内标片段避免和待检测的STR基因座的bp段相近或重叠。5.如权利要求4所述利用多色荧光内标动态校正DNA荧光光谱的方法，其特征在于：不同颜色标记的内标片段与待检测的STR基因座的bp段相距在10bp以上。6.如权利要求5所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：张涛，贾二惠，郭甜利，荣海博，金川，
申请(专利权)人：北京中盾安民分析技术有限公司，
类型：发明
国别省市：