基于毛细管凝胶电泳技术的核酸适配体荧光传感检测方法技术

本发明专利技术公开了一种基于毛细管凝胶电泳技术的核酸适配体荧光传感检测方法，通过选择可以与雌二醇特异性结合的核酸单链适配体，在适配体5

【技术实现步骤摘要】
基于毛细管凝胶电泳技术的核酸适配体荧光传感检测方法


[0001]本专利技术涉及生物检测
，具体涉及一种基于毛细管凝胶电泳技术的核酸适配体荧光传感检测方法。

技术介绍

[0002]核酸适配体作为一种新兴的技术手段，使核酸通过构象转变与靶标结合，因此利用核酸的检测手段即可实现靶标的鉴定。利用核酸适配体技术可以实现食品安全检查。
[0003]当前，核酸适配体技术主要有如下两种：
[0004]1)利用核酸适配体互补链，实现靶标的荧光传感：选择可以与靶标特异性结合的DNA单链作为适配体，并设计多条与适配体配对强度各异的互补链，利用荧光染料与双链DNA的特性结合进行检测。当加入靶标时，靶标和适配体互补链竞争与适配体结合，互补链被释放，被随后加入的核酸外切酶I(Exonuclease I)全部剪切。接着，利用双链特异性荧光染料对DNA浓度进行报告检测，得到靶标浓度与荧光强度的关系并定量分析。
[0005]2)基于金纳米复合材料和多肽构建的核酸适配体荧光传感器对靶标进行检测：利用未经荧光修饰的适配体链与复合材料共价固定，在加入具有防污性能的多肽消除生物污损等背景的作用下，与靶标结合后，引入携带荧光的核酸适配体链，形成类似于“三明治”结构的传感平台。
[0006]然而，方案1)中核酸互补链会与靶标形成竞争关系。荧光结合在互补链上，检测的是核酸互补链的荧光信号，不能直接反映靶标的信号。互补链对检测系统的干扰，影响核酸适配体与靶标的结合效率。方案2)中需要引入多肽分子，会改变核酸适配体的空间结构，影响核酸适配体与靶标的结合效率。

技术实现思路

[0007]针对现有技术的不足，本专利技术旨在提供一种基于毛细管凝胶电泳技术的核酸适配体荧光传感检测方法。
[0008]为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0009]一种基于毛细管凝胶电泳技术的核酸适配体荧光传感检测方法，具体过程为：
[0010]S1、准备核酸适配体；所述核酸适配体的序列为：
[0011]5’
FAM
‑
CGAAGCGCTAGAACATGGCACGTGACGGGGGATCTGGGATACCTGGCGGATCCGTGTAG TACATGAGACTTAGCTGATCCTGATGG
‑3’
[0012]5’
端采用FAM标记；
[0013]S2、制备雌二醇溶液：先用纯甲醇溶解制备得到1mg/ml的雌二醇溶液，再采用Tris
‑
HCl缓冲液稀释所述雌二醇溶液至目标浓度；于4℃冰箱备用；
[0014]S3、制备适配体与雌二醇的结合缓冲液；
[0015]S4、适配体和雌二醇的结合：向步骤S2所得的雌二醇溶液中加入核酸适配体溶液和结合缓冲液，于室温避光孵育，将样品稀释到目标浓度后，上样，采用毛细管凝胶电泳法
进行雌二醇检测。
[0016]进一步地，步骤S2中，Tris
‑
HCl缓冲液中包含100mmol/L Tris
‑
HCl、200mmol/L NaCl、25mmol/L KCl、10mmol/L MgCl2和质量5％乙醇，pH＝8.0。
[0017]进一步地，步骤S3中，所述结合缓冲液包括20mmol/L Tris、1mol/L NaCl和10mol/L MgCl2，pH＝7.4。
[0018]进一步地，步骤S4的具体过程为：向50ul 100ng/ml雌二醇溶液中加入50ul 1μmol/L的核酸适配体溶液以及50ul结合缓冲液，于室温避光孵育20分钟，将样品稀释到合适浓度后，取1ul上样，采用毛细管凝胶电泳法进行雌二醇检测。
[0019]本专利技术的有益效果在于：本专利技术方法通过选择可以与雌二醇特异性结合的核酸单链适配体，在适配体5
’
端进行荧光标记修饰，利用适配体与靶标结合后电泳速率的改变，实现雌二醇的检测。当加入雌二醇时，靶标与适配体特异结合，在毛细管凝胶电泳的条件下，适配体
‑
雌二醇复合物的电泳速率小于适配体的电泳速率。由于适配体5
’
端有荧光标记，当荧光物质被激光激发后，产生特征的荧光峰，通过对荧光峰的峰面积和峰型变化，实现雌二醇的检测。
[0020]本专利技术方法只采用单链核酸适配体进行靶标的检测，避免了互补链对检测系统的干扰，以及对核酸适配体结合效率的影响。另外，本专利技术使用的核酸适配体不需要引入多肽分子，核酸适配体与靶标一对一稳定结合，不会因多肽物质改变核酸适配体的空间结构。
附图说明
[0021]图1为本专利技术实施例2中结合缓冲液的优化的实验结果示意图；
[0022]图2为本专利技术实施例2中结合时间优化的实验结果示意图；
[0023]图3为本专利技术实施例2中适配体浓度优化的实验结果示意图；
[0024]图4为本专利技术实施例3中灵敏度测试的实验结果示意图；
[0025]图5为本专利技术实施例3中特异性测试的实验结果示意图。
具体实施方式
[0026]以下将结合附图对本专利技术作进一步的描述，需要说明的是，本实施例以本技术方案为前提，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本专利技术的保护范围并不限于本实施例。
[0027]实施例1
[0028]本实施例提供一种基于毛细管凝胶电泳技术的核酸适配体荧光传感检测方法，具体过程为：
[0029]S1、准备核酸适配体；所述核酸适配体的序列为：
[0030]5’
FAM
‑
CGAAGCGCTAGAACATGGCACGTGACGGGGGATCTGGGATACCTGGCGGATCCGTGTAG TACATGAGACTTAGCTGATCCTGATGG
‑3’
[0031]5’
端采用FAM标记；
[0032]S2、制备标准物质溶液：先用纯甲醇溶解制备得到1mg/ml的雌二醇标准储备溶液，再采用Tris
‑
HCl缓冲液(100mmol/L Tris
‑
HCl、200mmol/L NaCl,25mmol/L KCl、10mmol/L MgCl2和5％乙醇，pH＝8.0)稀释所述雌二醇标准储备溶液至目标浓度的雌二醇标准溶液；
于4℃冰箱备用；
[0033]S3、制备适配体与雌二醇的结合缓冲液，所述结合缓冲液包括20mmol/L Tris、1mol/L NaCl和10mol/L MgCl2，pH＝7.4。
[0034]S4、适配体和雌二醇的结合：向50ul 100ng/ml雌二醇标准溶液中加入50ul 1μmol/L的适配体溶液以及50ul结合缓冲液，于室温避光孵育20分钟，将样品稀释到合适浓度后，取1ul上样，采用毛细管凝胶电泳法进行检测。
[0035]实施例2
[0036]本实施例旨在通过实验说明实施例1中的结合缓冲液、结合时间、结合缓冲液浓度的优化。
[0037本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.基于毛细管凝胶电泳技术的核酸适配体荧光传感检测方法，其特征在于，具体过程为：S1、准备核酸适配体；所述核酸适配体的序列为：5
’
FAM
‑
CGAAGCGCTAGAACATGGCACGTGACGGGGGATCTGGGATACCTGGCGGATCCGTGTAG TACATGAGACTTAGCTGATCCTGATGG
‑3’5’
端采用FAM标记；S2、制备雌二醇溶液：先用纯甲醇溶解制备得到1mg/ml的雌二醇溶液，再采用Tris
‑
HCl缓冲液稀释所述雌二醇溶液至目标浓度；于4℃冰箱备用；S3、制备适配体与雌二醇的结合缓冲液；S4、适配体和雌二醇的结合：向步骤S2所得的雌二醇溶液中加入核酸适配体溶液和结合缓冲液，于室温避光孵育，将样品稀释到目标浓度后，上样，采...

【专利技术属性】
技术研发人员：荣海博，管桦，赵怡鹤，姜伯玮，王峰，李子晓，郭甜利，张涛，金川，
申请(专利权)人：北京中盾安民分析技术有限公司，
类型：发明
国别省市：