一种三色高通量测序试剂及测序方法技术

本发明专利技术属于高通量测序领域，公开了一种三色高通量测序试剂及测序方法，基于测序要求获取对应的待标记碱基以及质子海绵在不同的温度和环境下进行多次的搅拌，并将过滤得到的固体溶于水中；用TEAB梯度来做负离子交换柱对溶于水的固体进行纯化，然后再用HPLC纯化得到标记碱基；将所述标记碱基进行清洗后进行荧光标记测定，并在测定完成后，利用对应的化学试剂进行裂解，清洗后完成当前所述待标记碱基测序，对每一轮的测序过程均循环进行反应、清洗、读碱基、裂解和清洗这几个过程，使用的三色测序技术不但像2色测序技术一样加快了测序速度，而且碱基信号没有被分开检测，测序长度不但不受影响还会增加，从而提高了测序效率及测序通量。序通量。序通量。

【技术实现步骤摘要】
一种三色高通量测序试剂及测序方法


[0001]本专利技术涉及高通量测序
，尤其涉及一种三色高通量测序试剂及测序方法。

技术介绍

[0002]目前最常用(80％的高通量DNA测序市场)的高通量DNA测序技术是4色测序技术和2色测序技术，Illumina和华大基因都是用4色测序技术和2色测序技术。4色测序技术是ACGT 4种碱基各用一种颜色的染料标记来检测进行测序相应的碱基，总共要用4种不同波长的荧光染料来分别测序。2色测序技术是第一色和第二色分别标记4种碱基中的两种碱基，用第一色和第二色分别标记第三个碱基上后混起来用，第四个碱基不标记。2色测序技术的第一色和第二色分别检测第一和第二种碱基，两种颜色同时出现时检测到第三个碱基，没有荧光信号就相当于第4种碱基。2色测序技术相对于4色测序技术虽然测序速度加快了，但2色混合标记的碱基信号被一分为二，信号只有原本的大约50％。信号的减弱会降低信嘈比，影响测序读长，导致测序效率和测序通量降低。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的在于提供一种三色高通量测序试剂及测序方法，提高测序效率和测序通量。
[0004]为实现上述目的，第一当面，本专利技术提供了一种三色高通量测序方法，包括以下步骤：
[0005]基于测序要求获取对应的待标记碱基以及质子海绵在不同的温度和环境下进行多次的搅拌，并将过滤得到的固体溶于水中；
[0006]用0.1
‑
1M TEAB梯度来做负离子交换柱对溶于水的固体进行纯化，然后再用HPLC纯化得到标记碱基；
[0007]将所述标记碱基进行清洗后进行荧光标记测定，并在测定完成后，利用对应的化学试剂进行裂解，清洗后完成当前所述待标记碱基测序。
[0008]其中，基于测序要求获取对应的待标记碱基以及质子海绵在不同的温度和环境下进行多次的搅拌，并将过滤得到的固体溶于水中，包括：
[0009]基于测序要求获取对应的待标记碱基和质子海绵，并在含有五氧化二磷的真空干燥器中进行干燥过夜；
[0010]在不同的温度和环境下进行多次的搅拌，并将过滤得到的固体溶于水中。
[0011]其中，在不同的温度和环境下进行多次的搅拌，并将过滤得到的固体溶于水中，包括：
[0012]在0℃下，向所述真空干燥器中滴加定量的三氯氧磷并搅拌2小时；
[0013]在室温下，想所述真空干燥器中加入50毫升0.1M TEAB后搅拌1小时，然后在室温下加50ml浓氨水后搅拌过夜，抽掉水和氨后，将得到的固体溶于15ml水中。
[0014]其中，基于测序要求获取对应的待标记碱基和质子海绵，并在含有五氧化二磷的真空干燥器中进行干燥过夜之后，所述方法还包括：
[0015]向干燥完成后的所述真空干燥器中加入2毫升的磷酸三甲酯。
[0016]其中，碱基的标记方式为3
’‑
CL1
‑
O
‑5‑
X
‑
CL2 dNTP和3
’‑
CL1
‑
O
‑7‑
deaza
‑7‑
X
‑
CL2 dNTP中的任一种。
[0017]第二方面，本专利技术提供了一种三色高通量测序试剂，适用于如第一方面所述的一种三色高通量测序方法，所述三色高通量测序试剂包括三个待标记碱基、一个非荧光标记碱基、三种荧光染料和脱保护试剂，其中，三个所述待标记碱基和三种所述荧光染料任意组合标记，且三种所述荧光染料不重复使用，一个所述非荧光标记碱基为四种碱基中的任一种碱基。
[0018]其中，所述脱保护试剂为TCEP或THPP中的任一种。
[0019]其中，三种所述荧光染料为发绿光、黄光、红光、近红外光中的任意三种荧光染料的组合。
[0020]本专利技术的一种三色高通量测序试剂及测序方法，基于测序要求获取对应的待标记碱基以及质子海绵在不同的温度和环境下进行多次的搅拌，并将过滤得到的固体溶于水中；用0.1
‑
1M TEAB梯度来做负离子交换柱对溶于水的固体进行纯化，然后再用HPLC纯化得到标记碱基；将所述标记碱基进行清洗后进行荧光标记测定，并在测定完成后，利用对应的化学试剂进行裂解，清洗后完成当前所述待标记碱基测序，对每一轮的测序过程均循环进行反应、清洗、读碱基、裂解和清洗这几个过程，使用的三色测序技术不但像2色测序技术一样加快了测序速度，而且碱基信号没有被分开检测，测序长度不但不受影响还会增加，从而提高了测序效率及测序通量。
附图说明
[0021]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0022]图1是本专利技术提供的一种三色高通量测序方法的步骤示意图。
[0023]图2是本专利技术提供的实施例1的合成示意图。
[0024]图3是本专利技术提供的实施例2的合成示意图。
[0025]图4是本专利技术提供的实施例3的合成示意图。
[0026]图5是本专利技术提供的实施例4的合成示意图。
[0027]图6是本专利技术提供的实施例5的合成示意图。
[0028]图7是本专利技术提供的实施例6的合成示意图。
[0029]图8是本专利技术提供的三种染料发射最大光谱峰。
具体实施方式
[0030]下面详细描述本专利技术的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附
图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本专利技术，而不能理解为对本专利技术的限制。
[0031]在本专利技术的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。
[0032]请参阅图，本专利技术提供一种三色高通量测序方法，包括以下步骤：
[0033]S101、基于测序要求获取对应的待标记碱基以及质子海绵在不同的温度和环境下进行多次的搅拌，并将过滤得到的固体溶于水中。
[0034]具体的，基于测序要求获取对应的待标记碱基和质子海绵，并在含有五氧化二磷的真空干燥器中进行干燥过夜，向干燥完成后的所述真空干燥器中加入2毫升的磷酸三甲酯进行溶解，在0℃下，向所述真空干燥器中滴加定量的三氯氧磷并搅拌2小时；随后将1.817克三丁铵焦磷酸盐和1.84毫升三丁胺在8毫升无水DMF里混匀后在室温下一次加完后搅拌30分钟。
[0035]在室温下，想所述真空干燥器中加入50毫升0.1M TEAB后搅拌1小时，然后在室温下加50ml浓氨水后搅拌过夜，抽掉水和氨后，将得到的固体溶于15ml水中。
[0036]S102、用0.1
‑
1M TEAB梯度来做负离子交换柱对溶于水的固体进行纯化，然后再用HPLC纯化得到标记碱基。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种三色高通量测序方法，其特征在于，包括以下步骤：基于测序要求获取对应的待标记碱基以及质子海绵在不同的温度和环境下进行多次的搅拌，并将过滤得到的固体溶于水中；用0.1
‑
1M TEAB梯度来做负离子交换柱对溶于水的固体进行纯化，然后再用HPLC纯化得到标记碱基；将所述标记碱基进行清洗后进行荧光标记测定，并在测定完成后，利用对应的化学试剂进行裂解，清洗后完成当前所述待标记碱基测序。2.如权利要求1所述的三色高通量测序方法，其特征在于，基于测序要求获取对应的待标记碱基以及质子海绵在不同的温度和环境下进行多次的搅拌，并将过滤得到的固体溶于水中，包括：基于测序要求获取对应的待标记碱基和质子海绵，并在含有五氧化二磷的真空干燥器中进行干燥过夜；在不同的温度和环境下进行多次的搅拌，并将过滤得到的固体溶于水中。3.如权利要求2所述的三色高通量测序方法，其特征在于，在不同的温度和环境下进行多次的搅拌，并将过滤得到的固体溶于水中，包括：在0℃下，向所述真空干燥器中滴加定量的三氯氧磷并搅拌2小时；在室温下，想所述真空干燥器中加入50毫升0.1M TEAB后搅拌1小时，然后在室温下加50ml浓氨水后搅拌过夜，抽掉水和氨后，将得到的固体溶于15ml水中。4.如权利要求2所述的三色高通量测序方法，其特征在于，基于测序要求获取对...

【专利技术属性】
技术研发人员：向国兵，吕华，
申请(专利权)人：南京溯远基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：