体外高效扩增NK和转染NKG2D活化NK细胞的方法技术

本发明专利技术属于生物医药领域，细胞治疗技术范畴，具体是体外高效扩增NK和转染NKG2D活化NK细胞的方法。包括具体方法为：NK细胞体外高效扩增技术优化及NK免疫生物学特性检测；应用RT

【技术实现步骤摘要】
体外高效扩增NK和转染NKG2D活化NK细胞的方法


[0001]本专利技术属于生物医药领域，细胞治疗技术范畴，具体是体外高效扩增NK和转染NKG2D 活化NK细胞的方法。

技术介绍

[0002]采用新细胞因子组合方案在体外成功高效扩增高纯度NK细胞技术的基础上，继续优化 NK细胞临床产业化培养方案和选择NKG2D这一活化受体靶点分子，对NK细胞进行了 NKG2D修饰，期望获得具有更好靶向性、更高杀伤活性及持久性的靶向肿瘤细胞分子的NK 细胞，具有重要的临床价值和科学意义。
[0003]肿瘤在机体内的发生发展过程中，NK细胞均可以起到“控制”作用，基于NK细胞的肿瘤免疫治疗具有良好的临床应用前景。虽然NK细胞在临床应用上的安全性和疗效得到肯定，但由于它仅占外周血淋巴细胞的10％
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20％，因而如何获得高纯度、高质量的NK细胞成为治疗的关键。所以有必要建立一种NK细胞体外扩增技术，用于研究NK细胞的功能，并为肿瘤的细胞免疫治疗奠定基础。从产业化制备NK细胞的角度出发，建立NK细胞的高效扩增技术以及分析与功能相关的免疫表型等，为其下一步的临床应用奠定基础。
[0004]健康的供体可通过白细胞单采术及免疫磁珠分选来获得纯度很高的NK细胞，但使用这两种方法取的NK细胞过程中会造成细胞的活化及损失，故很难得到大量纯度很高的NK细胞，另外临床补充血源途径中脐血来源，由于脐血数量的限制而不能采用单采术来获得足量的NK细胞。传统的NK细胞扩增技术由于扩增效率不高且纯度不够未能得到广泛应用。在扩增的过程中添加辅助细胞提高NK细胞扩增效率等，并以此细胞来刺激NK细胞的增殖，但最后发现其结果并不十分理想。故通过何种办法能有效地在体外获得数量足够且纯度较高的NK细胞，这仍然是NK细胞临床治疗需要解决的问题。
[0005]研究发现，综合使用各种细胞因子或许在体外、体内有助于NK的增殖及效应功能。γ链细胞因子在NK细胞增殖及功能发挥上发挥了重要作用，该家族成员包括IL
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2、IL
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4、 IL
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7、IL
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9、IL
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15和IL
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21等。在NK细胞分化过程中，不同的细胞因子都具有不同的作用。
[0006]在前期利用不同细胞因子组合方法建立体外高效扩增高纯度NK细胞技术，拟进一步优化NK细胞培养方案，并为了提高NK细胞杀伤肿瘤细胞的特异性，继续对NK细胞进行基因修饰活化。
[0007]基因修饰可以作为一种技术手段改变细胞的功能，已经被广泛应用于多种细胞如T细胞、 DC、单核细胞和NK细胞等。尤其是对细胞进T行基因修饰，已经取得了长足进展。NK细胞在这方面的研究明显落后于T细胞，但随着理论研究的深入和技术手段的发展，已逐步走上正轨。
[0008]NK细胞表面存在识别靶细胞表面分子的活化受体和抑制性受体，NK细胞对靶细胞效应功能取决于活化信号与抑制性信号的综合，即何者占优势。活化受体识别经典、非经典的MHCI类分子或MHC I类相关分子，在NK活化的启动方面起关键作用，其中尤为引人注目的是 NKG2D，NKG2D不仅表达于所有的NK细胞，而且在NKT细胞和活化的巨噬细胞均有表达。
[0009]NKG2D识别的配基具有高度多态性的MHC
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I类链相关分子MICA、MICB及ULBP 1,2,3。在正常情况下，MICA和MICB表达仅限于胃肠上皮，但这些分子在许多上皮及非上皮来源的肿瘤细胞、病毒感染细胞和受到“应激性刺激”的细胞均有表达或上调。ULBPs虽然表达相对广泛，但正常处于低表达状态，在许多肿瘤组织呈现高表达。研究表明，NKG2D的单独活化即足以刺激NK细胞的活化，并能克服抑制性受体的强势信号，因此，在NK细胞活化过程中起着举足轻重的作用。
[0010]体外高效扩增NK和转染NKG2D活化NK细胞技术拟解决的关键问题有：(1)进一步优化产业化高效扩增高纯度NK细胞技术，主要采用细胞因子组合添加方法体外大规模培养 NK细胞，使用这些细胞因子时，考虑到一方面这些因子是NK功能有力激活剂，；另外一方面考虑高效扩增NK细胞的效应功能，适用于产业化生产NK细胞。(2)转染NKG2D涉及外源基因在哺乳动物细胞的表达的技术问题，其表达水平受基因拷贝、转录、翻译及翻译后修饰降解等多因素的影响。因此我们拟在进行NKG2D基因的表达研究中采用pEGFP
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N1与 NKG2D基因片段的ORF正确连接,目的基因在较强的CMV中早期启动子的作用下转录,以期获得较高的转录效率。

技术实现思路

[0011]本专利技术提供一种利用基因工程技术构建pEGFP
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N1/NKG2D真核荧光表达载体，将构建好的pEGFP
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N1/NKG2D质粒转染NK细胞，应用MTT方法检测NKG2D转染前后NK细胞的增殖情况和对肿瘤细胞系的杀伤效应，RT
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PCR方法检测相关杀伤分子IL
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2、TNF
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a、 Perforin、TWEAK的mRNA表达水平，为NK细胞用于肿瘤和肿瘤过继免疫治疗提供了新的思路的体外高效扩增NK和转染NKG2D活化NK细胞的方法。
[0012]本专利技术所采用的技术方案为：体外高效扩增NK和转染NKG2D活化NK细胞的方法，其特征在于：包括具体方法为：
[0013]S1：NK细胞体外高效扩增技术优化及NK免疫生物学特性检测；流式细胞仪检测CD3
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CD16+CD56+NK细胞亚群含量以及NK细胞上CD62L、激活性受体NKG2D、自然细胞毒受体NKp30、NKp44、NKp46、颗粒酶B、穿孔素的表达情况；
[0014]S2：应用RT
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PCR方法检测肿瘤细胞及肿瘤组织中NKG2D配体MICA，ULBP 1,2,3的 mRNA表达；
[0015]S3：NKG2D克隆载体的构建；从NK细胞中经RT
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PCR技术获得NKG2D cDNA，与 pGEM
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T Easy连接及转化大肠杆菌后，构建NKG2D克隆载体，进行DNA序列测定；
[0016]S4：NKG2D真核表达载体的构建；应用限制性内切酶将NKG2D基因从克隆载体上切下来，连接到荧光真核表达载体pEGFP
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N1上，构建pEGFP
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N1/NKG2D真核表达载体；
[0017]S5：真核表达载体在CHO细胞中的表达及鉴定；将筛选出的pEGFP
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N1/NKG2D质粒通过脂质体转染到CHO细胞中，经G418筛选，克隆，RT
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PCR鉴定NKG2D mRNA的表达，荧光显微镜、Western Blot和免疫组化方法鉴定NKG2D蛋白的表达；
[0018]S6：真核表达载体转染NK细胞及对NK细胞生物学功能影响。
[0019]所述N本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.体外高效扩增NK和转染NKG2D活化NK细胞的方法，其特征在于：包括具体方法为：S1：NK细胞体外高效扩增技术优化及NK免疫生物学特性检测；流式细胞仪检测CD3
‑
CD16+CD56+NK细胞亚群含量以及NK细胞上CD62L、激活性受体NKG2D、自然细胞毒受体NKp30、NKp44、NKp46、颗粒酶B、穿孔素的表达情况；S2：应用RT
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PCR方法检测肿瘤细胞及肿瘤组织中NKG2D配体MICA，ULBP 1,2,3的mRNA表达；S3：NKG2D克隆载体的构建；从NK细胞中经RT
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PCR技术获得NKG2D cDNA，与pGEM
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TEasy连接及转化大肠杆菌后，构建NKG2D克隆载体，进行DNA序列测定；S4：NKG2D真核表达载体的构建；应用限制性内切酶将NKG2D基因从克隆载体上切下来，连接到荧光真核表达载体pEGFP
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N1上，构建pEGFP
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N1/NKG2D真核表达载体；S5：真核表达载体在CHO细胞中的表达及鉴定；将筛选出的pEGFP
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N1/NKG2D质粒通过脂质体转染到CHO细胞中，经G418筛选，克隆，RT
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PCR鉴定NKG2D mRNA的表达，荧光显微镜、Western Blot和免疫组化方法鉴定NKG2D蛋白的表达；S6：真核表达载体转染NK细胞及对NK细胞生物学功能影响。2.根据权利要求1所述的体外高效扩增NK和转染NKG2D活化NK细胞的方法，其特征在于：所述NK细胞体外高效扩增方案标准操作流程：S1：包被：T 175培养瓶中8mlDPBS加入组合细胞因子，置于37℃培养箱中，包被2小时；S2：第一天：细胞制备；A：抽取抗凝外周血50ml，800g，15min室温离心；B：自体血浆制备：取上清血浆，置于水浴锅中56℃，30min；然后
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20℃静置10min；最后4℃，1100g，离心15min，4℃保存备用；C：取上述离心后下部细胞成分，加D
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PBS至50ml，混匀，加到2个装有20ml医疗级淋巴细胞分离液的50ml离心管中，800g，15min室温离心；D：取细胞层，加入培养基至50ml，600g 10min，弃上清液；E：分离出的PBMC加入40ml组合细胞因子，制成细胞悬液，加入到弃掉包被液的培养瓶中，加入2ml血浆，置于饱和湿度、37℃、5.0％CO2培养箱中培养；F：NK培养液配置方法：活化培养基为500ml增殖培养基中加入组合细胞因子，增殖培养基为每1000mlNK
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EX培养基加入组合细胞因子，先使用完活化培养基，再使用增殖培养基；S3：第四天：加入40mlNK活化培养基重悬，种入原培养瓶，加入4ml血浆，加入本试剂盒组合细胞因子；S4：第六天：补加70mlNK活化培养基，加入4ml血浆，加入组合细胞因子；S5：第八天：将培养瓶中细胞完全吹打下来，加入剩下血浆，转移到1个培养袋，建议补至400ml；S6：第十天：视细胞生长状态，每个培养袋补加NK培养液400ml；S7：第十一天：视细胞生长状态，每个培养袋补加NK培养液700ml；送检第三方做细菌、真菌、支原体、内毒素检测同时做好自检；S8：第十五天：收集NK细胞悬液1500ml，1500rpm
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8min离心后弃去上清液，250ml离心管集2管每管生理盐水200ml洗涤1500rpm
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8min1次，再用50ml离心管生理盐水100ml洗涤1200rpm
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【专利技术属性】
技术研发人员：徐健，李陶，张扬，
申请(专利权)人：浙江圣希澳医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：