本发明专利技术涉及β‑甘露聚糖酶耐热突变体M23、重组菌及其应用，属于基因工程和酶工程领域，本发明专利技术采用蛋白质表面电荷优化策略，理性设计并筛选突变位点，将白曲霉来源的β‑甘露聚糖酶ManAK进行改良，再通过高通量筛选方法挑选正向突变，最终获得热稳定性提高的23株β‑甘露聚糖酶突变体。本发明专利技术获得的β‑甘露聚糖酶突变体耐热性是原始基因的1.2～3.5倍，耐热性均有显著提高，有利于实现其在商业中的应用，从而降低生产成本。
【技术实现步骤摘要】
β-甘露聚糖酶耐热突变体M23、重组菌及其应用
本专利技术属于基因工程和酶工程领域，具体涉及一类β-甘露聚糖酶耐热突变体、重组菌及其应用。
技术介绍
甘露聚糖是半纤维素的第二大组分，由吡喃甘露糖通过β-1,4糖苷键连接而成。甘露聚糖的彻底降解需要甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、葡萄糖苷酶、半乳糖苷酶和脱乙酰酯化酶的协同作用。其中，甘露聚糖酶为降解过程的关键酶。β-甘露聚糖酶(EC3.2.1.78)能通过催化β-1,4甘露糖苷键将甘露聚糖水解为甘露糖和甘露低聚糖。该酶作为一种重要的工业用酶制剂，被广泛应用于动物饲料、食品加工、医药、纺织、生物漂白以及石油等可再生能源领域。其中一些应用领域，特别是饲料制粒、可再生能源生产等过程需要进行高温处理，这就要求所开发的β-甘露聚糖酶具有良好的耐热性能。耐热酶的最适作用温度在60℃以上，较高的反应温度，降低了杂菌的污染，减少了杂菌代谢产物的干扰，可提高酶的催化能力和催化效率，极大降低生产成本。目前，市面上存在的β-甘露聚糖酶耐热性往往达不到工业要求,导致其在生产运输过程中生物活性不稳定，严重限制该酶应用。因此，开发具有优良耐热性的β-甘露聚糖酶具有重要工业意义和经济价值。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种耐热性提高的β-甘露聚糖酶突变体。本专利技术通过理性设计，采用蛋白质表面电荷优化策略，通过筛选设计位点，对白曲霉来源的β-甘露聚糖酶ManAK(氨基酸序列SEQIDNO：1，核苷酸序列SEQIDNO：2)进行改良，得到热稳定性提高的β-甘露聚糖酶单位点突变体。本专利技术的另一目的是提供了包含上述突变的β-甘露聚糖酶基因的重组载体。将突变得到的β-甘露聚糖酶基因插入到表达载体合适位点，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接，得到重组酵母表达质粒。本专利技术还提供了包含上述β-甘露聚糖酶基因的重组菌株，所述菌株为酵母菌。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案:一种耐热性提高的单位点β-甘露聚糖酶突变体，所述的β-甘露聚糖酶突变体为M7(D97N),是由氨基酸序列为SEQIDNO：1的β-甘露聚糖酶的第97位氨基酸天冬氨酸(D)变为天冬酰胺(N)获得；或者所述的β-甘露聚糖酶突变体为M8(D107N),是由氨基酸序列为SEQIDNO：1的β-甘露聚糖酶的第107位氨基酸天冬氨酸(D)变为天冬酰胺(N)获得；或者所述的β-甘露聚糖酶突变体为M9(D113N),是由氨基酸序列为SEQIDNO：1的β-甘露聚糖酶的第113位氨基酸天冬氨酸(D)变为天冬酰胺(N)获得；或者所述的β-甘露聚糖酶突变体为M10(D123N),是由氨基酸序列为SEQIDNO：1的β-甘露聚糖酶的第123位氨基酸天冬氨酸(D)变为天冬酰胺(N)获得；或者所述的β-甘露聚糖酶突变体为M11(D136N),是由氨基酸序列为SEQIDNO：1的β-甘露聚糖酶的第136位氨基酸天冬氨酸(D)变为天冬酰胺(N)获得；或者所述的β-甘露聚糖酶突变体为M12(D151N),是由氨基酸序列为SEQIDNO：1的β-甘露聚糖酶的第151位氨基酸天冬氨酸(D)变为天冬酰胺(N)获得；或者所述的β-甘露聚糖酶突变体为M13(D154N),是由氨基酸序列为SEQIDNO：1的β-甘露聚糖酶的第154位氨基酸天冬氨酸(D)变为天冬酰胺(N)获得；或者所述的β-甘露聚糖酶突变体M14(D159N),是由氨基酸序列为SEQIDNO：1的β-甘露聚糖酶的第159位氨基酸天冬氨酸(D)变为天冬酰胺(N)获得；或者所述的β-甘露聚糖酶突变体为M15(D197N),是由氨基酸序列为SEQIDNO：1的β-甘露聚糖酶的第197位氨基酸天冬氨酸(D)变为天冬酰胺(N)获得；或者所述的β-甘露聚糖酶突变体为M16(D203N),是由氨基酸序列为SEQIDNO：1的β-甘露聚糖酶的第203位氨基酸天冬氨酸(D)变为天冬酰胺(N)获得；或者所述的β-甘露聚糖酶突变体为M17(D216N),是由氨基酸序列为SEQIDNO：1的β-甘露聚糖酶的第216位氨基酸天冬氨酸(D)变为天冬酰胺(N)获得；或者所述的β-甘露聚糖酶突变体为M18(D218N),是由氨基酸序列为SEQIDNO：1的β-甘露聚糖酶的第218位氨基酸天冬氨酸(D)变为天冬酰胺(N)获得；或者所述的β-甘露聚糖酶突变体为M19(D225N),是由氨基酸序列为SEQIDNO：1的β-甘露聚糖酶的第225位氨基酸天冬氨酸(D)变为天冬酰胺(N)获得；或者所述的β-甘露聚糖酶突变体为M20(D233N),是由氨基酸序列为SEQIDNO：1的β-甘露聚糖酶的第233位氨基酸天冬氨酸(D)变为天冬酰胺(N)获得；或者所述的β-甘露聚糖酶突变体为M21(D235N),是由氨基酸序列为SEQIDNO：1的β-甘露聚糖酶的第235位氨基酸天冬氨酸(D)变为天冬酰胺(N)获得；或者所述的β-甘露聚糖酶突变体为M22(D255N),所述的突变体M22由氨基酸序列为SEQIDNO：1的β-甘露聚糖酶的第255位氨基酸天冬氨酸(D)变为天冬酰胺(N)获得；或者所述的β-甘露聚糖酶突变体为M23(D258N),是由氨基酸序列为SEQIDNO：1的β-甘露聚糖酶的第258位氨基酸天冬氨酸(D)变为天冬酰胺(N)获得,氨基酸序列如SEQIDNO：3所示；或者所述的β-甘露聚糖酶突变体为M24(D267N),是由氨基酸序列为SEQIDNO：1的β-甘露聚糖酶的第267位氨基酸天冬氨酸(D)变为天冬酰胺(N)获得；或者所述的β-甘露聚糖酶突变体为M25(D273N),是由氨基酸序列为SEQIDNO：1的β-甘露聚糖酶的第273位氨基酸天冬氨酸(D)变为天冬酰胺(N)获得；或者所述的β-甘露聚糖酶突变体为M26(D274N),是由氨基酸序列为SEQIDNO：1的β-甘露聚糖酶的第274位氨基酸天冬氨酸(D)变为天冬酰胺(N)获得；或者所述的β-甘露聚糖酶突变体为M30(D341N),是由氨基酸序列为SEQIDNO：1的β-甘露聚糖酶的第341位氨基酸天冬氨酸(D)变为天冬酰胺(N)获得；或者所述的β-甘露聚糖酶突变体为M33(D359N),是由氨基酸序列为SEQIDNO：1的β-甘露聚糖酶的第359位氨基酸天冬氨酸(D)变为天冬酰胺(N)获得；或者所述的β-甘露聚糖酶突变体为M41(E244Q),是由氨基酸序列为SEQIDNO：1的β-甘露聚糖酶的第244位氨基酸谷氨酸(E)变为谷氨酰胺(Q)获得。本专利技术提供了所述β-甘露聚糖酶突变体的应用本专利技术提供了含有所述的β-甘露聚糖酶突变体编码基因的重组菌株，所述重组菌株为毕赤酵母X33。本专利技术与现有技术相比的有益效果：本专利技术提供了分别产生所述β-甘露聚糖酶突变体的氨基酸序列。基于SEQIDNO：1的β-甘露聚糖酶ManAK，通过理性设计，设计筛选位点，在SEQIDNO：1不同位点进本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种耐热性提高的单位点β-甘露聚糖酶突变体M23，其特征在于所述β-甘露聚糖酶突变体M23的氨基酸序列为：SEQ ID NO:3。/n
【技术特征摘要】
1.一种耐热性提高的单位点β-甘露聚糖酶突变体M23，其特征在于所述β-甘露聚糖酶突变体M23的氨基酸序列为：SEQIDNO:3。
2.含有权利要求1所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：牟海津，刘哲民，宁晨，张芳，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：山东;37
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