蛋白质UGT236及其编码基因与应用制造技术

本发明专利技术公开了蛋白质UGT236及其编码基因与应用。蛋白质UGT236为氨基酸序列是SEQ ID NO:2所示的蛋白质。实验证明，蛋白质UGT236具有糖基转移酶的活性，可高效的将根皮素催化生成根皮苷，即蛋白质UGT236可用于以根皮素为底物制备根皮苷。本发明专利技术具有重要的应用价值。

【技术实现步骤摘要】
蛋白质UGT236及其编码基因与应用
本专利技术属于生物
，具体涉及蛋白质UGT236及其编码基因与应用。
技术介绍
根皮苷是一种二氢查耳酮的2’-葡萄糖苷，广泛存在于苹果根、茎、叶和果实等组织中。最近发现壳斗科石柯属常绿植物多穗石柯也含有丰富的根皮苷，幼叶中含量高达3.1％。近年来研究发现，根皮苷具有多种药理活性，如抗氧化、抗高血糖和并发症、降脂、抗炎、抗肿瘤、保护视网膜、保护肝脏、美白、杀菌等多种活性，这预示着根皮苷在医药、美容、农业等多个领域都具有潜在的开发价值。根皮苷目前主要从苹果树枝或多穗石柯等植物中提取，容易受到资源等方面的限制，且植物中存在类似的化合物，分离纯化流程冗长，同时还容易造成环境污染。随着合成生物学技术的发展，从植物中挖掘根皮苷生物合成途径的关键酶基因，在异源微生物中重构其生物合成途径来直接生产根皮苷成为一种最具前景的方式。根皮苷生物合成的最后关键步骤是根皮素在特定糖基转移酶的催化下，在2’-OH上加上葡萄糖，最后生成根皮苷。目前已从苹果和其它物种中鉴定了多个糖基转移酶能催化根皮素生成根皮苷，但多存在活性偏低且容易生成副产物的缺点，这也限制了其在根皮苷生物合成中的应用。从植物中鉴定或通过酶工程改造获得活性更高且更专一的糖基转移酶，是目前根皮苷生物合成研究中热点。菘蓝(IsatisindigoticaFort.)为十字花科菘蓝属两年生草本植物。菘蓝根为板蓝根、叶为大青叶来源之一，均为常用中药，具有清热解毒、凉血利咽之功效，临床上常用于流行性感冒、流行性腮炎、流行性乙型脑炎、急慢性肝炎、带状疱疹等疾病的治疗。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种可以将根皮素催化生成根皮苷的糖基转移酶。本专利技术提供的糖基转移酶，名称为蛋白质UGT236，来源于菘蓝。所述蛋白质UGT236可为如下a1)或a2)或a3)：a1)氨基酸序列是SEQIDNO:2所示的蛋白质；a2)在SEQIDNO:2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；a3)将a1)或a2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有将根皮素催化生成根皮苷的糖基转移酶活性的蛋白质。其中，SEQIDNO:2由482个氨基酸残基组成。为了使a1)中的蛋白质便于纯化，可在SEQIDNO:2所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。表1.标签的序列标签残基序列Poly-Arg5-6(通常为5个)RRRRRFLAG8DYKDDDDKStrep-tagII8WSHPQFEKc-myc10EQKLISEEDL上述a3)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。上述a3)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述a3)中的蛋白质的编码基因可通过将SEQIDNO:1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。编码所述蛋白质UGT236的核酸分子也属于本专利技术的保护范围。所述编码所述蛋白质UGT236的核酸分子具体可为如下b1)或b2)或b3)或b4)所示的DNA分子：b1)编码区是SEQIDNO:1所示的DNA分子；b2)核苷酸序列是SEQIDNO:1所示的DNA分子；b3)与b1)或b2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，来源于菘蓝且编码所述蛋白质UGT236的DNA分子；b4)在严格条件下与b1)或b2)限定的核苷酸序列杂交，来源于菘蓝且编码所述蛋白质UGT236的DNA分子。其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。其中，SEQIDNO:1由1449个核苷酸组成，SEQIDNO:1的核苷酸编码SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本专利技术的编码所述蛋白质UGT236的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本专利技术分离得到的所述蛋白质UGT236的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码所述蛋白质UGT236，均是衍生于本专利技术的核苷酸序列并且等同于本专利技术的序列。这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本专利技术的编码SEQIDNO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质UGT236的核苷酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。含有上述任一所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物也属于本专利技术的保护范围。所述含有上述任一所述核酸分子的重组载体可为在表达载体的多克隆位点插入SEQIDNO:1所示的DNA分子得到的重组质粒。所述含有上述任一所述核酸分子的重组载体具体可为实施例提及的重组质粒pET28a-HIS-MBP-UGT236。所述重组质粒pET28a-HIS-MBP-UGT236为将pET28a-HIS-MBP原核表达载体的限制性内切酶BamHI识别序列和限制性内切酶NotI识别序列间的DNA小片段替换为核苷酸序列是SEQIDNO:1所示的DNA分子，得到的重组质粒。所述pET28a-HIS-MBP原核表达载体(环形)的核苷酸序列可如SEQIDNO:3所示。所述含有上述任一所述核酸分子的重组微生物可为将含有上述任一所述核酸分子的重组载体导入出发微生物得到的重组菌。所述出发微生物可为大肠杆菌。所述大肠杆菌具体可为E.coliRossetta(DE3)。所述含有上述任一所述核酸分子的重组微生物具体可为实施例提及的重组菌甲。本专利技术还保护上述任一所述蛋白质UGT236，或，上述任一所述核酸分子，或，含有上述任一所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物，的应用，可为如下c1)或c2)：c1)作为糖基转移酶的应用；c2)在制备具有糖基转移酶功能的产品中的应用；所述糖基转移酶具有将根皮素催化生成根皮苷的活性。本专利技术还保护上述任一所述蛋白质UGT236，或，上述任一所述核酸分子，或，含有上述任一所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物，的应用，可为如下c3)或c4)：c3)在生产根皮苷中的应用；c4)在制备用于生产根皮苷的产品中的应用。上述应用中，所述本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.蛋白质UGT236，为如下a1)或a2)或a3)：/na1)氨基酸序列是SEQ ID NO:2所示的蛋白质；/na2)在SEQ ID NO:2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；/na3)将a1)或a2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有将根皮素催化生成根皮苷的糖基转移酶活性的蛋白质。/n

【技术特征摘要】
1.蛋白质UGT236，为如下a1)或a2)或a3)：
a1)氨基酸序列是SEQIDNO:2所示的蛋白质；
a2)在SEQIDNO:2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
a3)将a1)或a2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有将根皮素催化生成根皮苷的糖基转移酶活性的蛋白质。


2.编码权利要求1所述蛋白质UGT236的核酸分子。


3.如权利要求2所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子为如下b1)或b2)或b3)或b4)所示的DNA分子：
b1)编码区是SEQIDNO:1所示的DNA分子；
b2)核苷酸序列是SEQIDNO:1所示的DNA分子；
b3)与b1)或b2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，来源于菘蓝且编码权利要求1所述蛋白质UGT236的DNA分子；
b4)在严格条件下与b1)或b2)限定的核苷酸序列杂交，来源于菘蓝且编码权利要求1所述蛋白质UGT236的DNA分子。


4.含有权利要求2或3所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物。


5.如权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为在表达载体的多克隆位点插入SEQIDNO:...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄璐琦，唐金富，杨健，郭娟，曾雯，姜银银，
申请(专利权)人：中国中医科学院中药研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11