齐墩果酸葡糖醛酸转移酶及其编码基因和应用制造技术

本发明专利技术涉及齐墩果酸葡糖醛酸转移酶及其编码基因和应用，属于植物基因工程和生物技术领域。本发明专利技术齐墩果酸葡糖醛酸转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。本发明专利技术齐墩果酸葡糖醛酸转移酶能够特异性地以尿苷二磷酸葡糖醛酸为糖基供体，催化齐墩果酸C‑3位的糖基化反应，从而生成齐墩果酸3‑O‑β‑葡糖醛酸。该转移酶是在齐墩果烷型皂苷合成过程中上游步骤的酶，这对于解析齐墩果烷型皂苷的合成途径，具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
齐墩果酸葡糖醛酸转移酶及其编码基因和应用
本专利技术属于植物基因工程和生物
，具体涉及齐墩果酸葡糖醛酸转移酶及其编码基因和应用。
技术介绍
姜状三七(PanaxzingiberensisC.Y.WuetK.M.Feng)为五加科人参属多年生草本植物，分布于云南东南部、尼泊尔中部、不丹高海拔地区、缅甸东枝、掸邦等地。姜状三七根茎肉质如姜块状，属濒危种，由于过度开发，目前野生资源极其稀少。姜状三七有散瘀、定痛、止血等功效，主治跌打损伤、骨折、吐血、功能性子宫出血、外伤出血等症。皂苷为姜状三七的主要活性成分，主要含有达玛烷型皂苷和齐墩果烷型皂苷，其中以齐墩果烷型皂苷为主，如人参皂苷RO，竹节参皂苷IV和竹节参皂苷IVa。齐墩果烷型皂苷具有抗肿瘤、降血脂、降血糖、保肝等药理作用。齐墩果烷型皂苷是从齐墩果酸3-O-β-葡糖醛酸转化而来的，而齐墩果酸3-O-β-葡糖醛酸则是齐墩果酸经过一种未知的葡糖醛酸转移酶(OAGT)催化形成的。尽管在其他人参属植物中也含有丰富的齐墩果烷型皂苷，并已报道了它们的转录组信息，但是没有鉴定出参与齐墩果烷型皂苷合成的糖基转移酶。因此如何克服现有技术的不足是目前植物基因工程和生物
亟需解决的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决现有技术的不足，提供齐墩果酸葡糖醛酸转移酶及其编码基因和应用，该齐墩果酸葡糖醛酸转移酶能在合成齐墩果烷型皂苷的前体中起作用，从而为鉴定齐墩果烷型皂苷的其他修饰奠定基础。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：齐墩果酸葡糖醛酸转移酶，所述齐墩果酸葡糖醛酸转移酶的氨基酸序列如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3或SEQIDNO.4所示。本专利技术同时保护编码上述述齐墩果酸葡糖醛酸转移酶的基因。具体为：所述基因的编码序列是SEQIDNO.5、SEQIDNO.6、SEQIDNO.7或SEQIDNO.8所示的核苷酸序列。本专利技术的另一目的是提供一种含有齐墩果酸葡糖醛酸转移酶基因的重组载体，是将SEQIDNO.5、SEQIDNO.6、SEQIDNO.7或SEQIDNO.8所示基因直接与不同表达载体连接所构建的重组载体。同时，本专利技术保护重组载体转化得到的重组基因工程菌。本专利技术还涉及上述齐墩果酸葡糖醛酸转移酶在合成齐墩果烷型皂苷中的应用。具体的应用方法是：以齐墩果酸葡糖醛酸转移酶为催化剂，以尿苷二磷酸葡糖醛酸为底物催化齐墩果酸生成齐墩果酸3-O-β-葡糖醛酸。本专利技术申请人发现姜状三七是研究齐墩果烷型皂苷合成的理想材料，在本专利技术中，利用IlluminaHiSeqTM2000测序平台建立了姜状三七的转录组数据库，并功能识别了在齐墩果烷型皂苷生物合成中的关键步骤，即催化齐墩果酸形成齐墩果酸3-O-β-葡糖醛酸的葡糖醛酸转移酶编码酶基因。本专利技术首次对筛选到的4个编码齐墩果酸葡糖醛酸转移酶的基因(3个来自姜状三七，1个来自另一种含有齐墩果烷型皂苷的人参属植物竹节参)进行酶活性检测，发现这种齐墩果酸葡糖醛酸转移酶特异性地将葡糖醛酸转移到齐墩果酸的C-3位上，形成齐墩果酸3-O-β-葡糖醛酸。本专利技术为姜状三七研究提供了有价值的遗传信息，为齐墩果烷型人参皂苷的生物合成提供了候选基因，为进一步进行基因功能识别奠定了基础。本专利技术与现有技术相比，其有益效果为：1、本专利技术的齐墩果酸糖基转移酶能够以尿苷二磷酸葡糖醛酸(UDP-GlcA)为糖基供体，特异性地催化齐墩果酸C3位的糖基化反应。2、本专利技术为姜状三七研究提供了有价值的遗传信息，为齐墩果烷型人参皂苷的生物合成提供了候选基因，为进一步进行基因功能识别奠定了基础。3、本专利技术克隆的齐墩果酸糖基转移酶是在皂苷合成过程中关键步骤的酶，这对于解析齐墩果烷型皂苷的合成途径，揭示人参属植物中人参皂苷合成的分子机理，进而为建立药用植物三萜皂苷异源合成系统奠定基础，对于促进人参属植物三萜皂苷生物合成，提高其产量具有重要意义。附图说明图1为参与人参皂苷生物合成的UGT聚类分析图。其中，标注三角形的6条unigene与BvUGT73C10–UGT73C13同源性较高。据报道，欧洲山芥UGT73C10–UGT73C13可催化齐墩果烷型皂苷齐墩果酸和常春藤皂苷元的3-O-糖基化(Augustin等，2012)，因此推测这6条基因可能具有催化齐墩果酸3-O-糖基化的作用。各序列在NCBI数据库中的编号如下：人参，UGTPg101(AKQ76389)，UGTPg1(AIE12479)，UGTPg100(AKQ76388)，PgUGT94Q2(AGR44632)，UGTPg29(AKA44579)，UGTPg45(AKA44586)，PgUGT74AE2(AGR44631)；西洋参，Pq3-O-UGT2(ALE15280)；蒺藜苜蓿MtUGT71G1(AAW56092)，MtUGT73F3(ACT34898)，MtUGT73K1(AAW56091)；水稻，OsUGT707A3(BAC83989)，OsUGT706C1(BAB68090)，OsUGT706D1(BAB68093)，OsUGT709A4(BAC80066)，OsRUGT-10(BAD69345)；番红花，CsUGT707B1(CCG85331)，CsGT45(ACM66950)，CsUGT84A22(ALO19890)，CsUGT78A14(ALO19888)；王不留行，SvUGT74M1(ABK76266)；大豆，GmUGT73F4(BAM29363)，GmUGT73F2(BAM29362)，GmSGT2(BAI99584)，GmSGT3(BAI99585)；刺茄，SaGT4A(BAD89042)；拟南芥，AtUGT73C5(OAP09184)，AtUGT73C6(OAP07438)；欧洲山芥，BvUGT73C10(AFN26666)，BvUGT73C11(AFN26667)，BvUGT73C12(AFN26668)，BvUGT73C13(AFN26669)。图2为pCzn1-jzsqUnigene0023775(RC)测序验证与预期序列进行比对图。图3为重组质粒pCzn1-jzsqUnigene0023775(RC)酶切鉴定结果，其中，标记(Marker)：200,500,800,1200,2000,3000,4500；M：标记；1:酶切前质粒；2:酶切后质粒。图4为重组表达载体图谱；其中，MCS：多克隆位点；TEE：翻译增强元件；cspA：冷休克蛋白；Lac：乳糖操纵子；Amp：氨苄青霉素。图5为蛋白表达鉴定SDS-PAGE分析图；其中，M:蛋白质分子质量标准；1:未诱导；2:诱导后；3:诱导破碎后上清；4:诱导破碎后沉淀。图6为蛋白纯化SDS-PAGE分析图；M:蛋白质分子质量标准；1:破碎后处理样品；2:流出；3:洗脱。图7为蛋白West本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.齐墩果酸葡糖醛酸转移酶，其特征在于，所述齐墩果酸葡糖醛酸转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。/n

【技术特征摘要】
1.齐墩果酸葡糖醛酸转移酶，其特征在于，所述齐墩果酸葡糖醛酸转移酶的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示。


2.编码权利要求1所述齐墩果酸葡糖醛酸转移酶的基因。


3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，所述基因的编码序列是SEQIDNO.8所示的核苷酸序列。


4.含...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨生超，唐卿雁，张广辉，范伟，陈庚，
申请(专利权)人：云南农业大学，
类型：发明
国别省市：云南;53