一种三重信号放大磁弛豫传感免疫分析方法技术

本发明专利技术公开了一种三重信号放大磁弛豫传感免疫分析方法，该方法在金纳米粒子介导下，通过富集引发链DNA并进行杂交链(HCR)反应，HCR产物上的生物素与链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶结合并快速催化多巴胺转化为聚多巴胺，从而吸附溶液中具有磁信号的Fe

【技术实现步骤摘要】
一种三重信号放大磁弛豫传感免疫分析方法
本专利技术属于检测分析领域，涉及一种磁弛豫传感免疫分析方法，尤其是一种三重信号放大的磁弛豫传感免疫分析方法。
技术介绍
基于磁性纳米粒子的磁弛豫(magneticrelaxationswitching,MRS)传感器因其信噪比高、背景干扰少、操作方便、预处理过程简单的优点在生化分析中得到了广泛的应用，其原理是基于生物分子之间的相互作用来改变磁性纳米颗粒(magneticnanoparticles,MNPs)的状态(通常是分散状态变为聚集状态或MNPs的数量减少)，从而改变周围环境中水分子质子的横向弛豫时间(T2)。将T2的变化值作为信号输出，以达到检测复杂样品中目标物的目的。但是，由于缺乏有效的信号放大系统，传统的MRS传感器灵敏度低，无法有效检测痕量物质。而且，传统MRS传感器基于生物分子之间的相互作用导致MNPs状态的改变，MNPs的状态变化是可逆的，所以会导致MRS的稳定性较差。因此，有效的信号放大系统和稳定的信号读出方式是提高MRS传感器分析性能的两个关键因素。最近，研究发现通过使用氧化还原反应改变顺磁离子的价态，可以使纵向弛豫时间(T1)或T2信号产生变化，由此开发了一系列用于生化分析的顺磁离子介导的MRS传感器。顺磁离子产生的磁信号比MNPs产生的磁信号更稳定，因此检测结果更准确。但是，顺磁离子介导的MRS传感器的灵敏度仍比较低，还是无法检测痕量物质。盐酸多巴胺(DA)是一种具有邻苯二酚和胺的生物分子，可在空气中发生自聚形成聚多巴胺。聚多巴胺(PDA)具有良好的稳定性和生物相容性，很适合作为表面改性剂附着在有机和无机材料的表面上。PDA上的邻苯二酚配体还显示出与某些金属离子产生强相互作用的配位键。例如在纤维素纳米晶体上修饰PDA(PDA@CNC)，该探针遇到Fe3+后，将通过PDA和Fe3+的配位键作用使Fe3+快速聚结，因此对Fe3+具有很好的吸附能力。此外，辣根过氧化物酶(HRP)可以显著促进DA的自聚合(提高约100倍)。因此，我们使用HRP催化DA转化为PDA以吸附Fe3+，从而导致上清液中Fe3+数量发生极大的变化，而磁信号(T2)与Fe3+数量成正相关，进而进行信号读出及放大。近年来，各种核酸信号扩增策略层出不穷，并被应用到分析和检测领域。其中，支点介导的链置换反应，包括催化发夹自组装(CHA)、杂交链反应(HCR)和无酶信号放大的熵驱动策略最引人注目。因为其具备反应条件温和，来源广泛，价格便宜且易于获得的优势。引发链DNA(iDNA)可以触发HCR反应，形成长DNA双链产物。因此本专利技术使用金纳米颗粒(AuNPs)富集iDNA，再通过HCR产物富集HRP，最后利用HRP催化DA转变为PDA对Fe3+进行吸附，以实现三重信号放大，显著提高MRS传感器的灵敏度。在本专利技术中，开发了一种基于金纳米颗粒(AuNPs)介导的三重自组装级联信号放大(TC-MRS)的MRS传感器。在此，AuNPs通过偶联抗体和iDNA形成Ab-AuNPs-iDNA检测探针，该过程富集了iDNA，形成第一重信号放大。在存在目标物的情况下，目标物与固定在酶标板底部的完全抗原竞争结合Ab-AuNPs-iDNA，Ab-AuNPs-iDNA可以打开由生物素修饰的两个稳定的DNA发夹(bio-H1和bio-H2)，以触发HCR反应产生长HCR产物，实现第二重信号放大。较长的HCR产物能与更多的辣根过氧化物酶-链霉亲和素(HRP-SA)结合，以快速催化DA转化为PDA，实现第三重信号放大。本项目将顺磁离子Fe3+作为磁信号探针，相较于磁性纳米颗粒，Fe3+不仅在水溶液中保持稳定且均匀，而且由于电子结构(半填充的d轨道和长的电子自旋弛豫)可以对周围的水分子质子产生强烈的影响。Fe3+通过PDA被吸附到酶标板底部，从而导致上清液中Fe3+的数量发生变化，T2信号随之发生显著变化，通过低场核磁共振分析仪快速测量。TC-MRS由于具有三重信号放大策略而具有很高的检测灵敏度，并且由于特异性的抗体-抗原相互作用而具有很高的特异性。与通过生物分子相互作用的传统MRS信号读取相比，该方法稳定性、灵敏度显著提高。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种三重信号放大磁弛豫传感免疫分析方法，该方法在金纳米粒子介导下，通过富集iDNA并进行HCR反应，HCR产物上的生物素与HRP-链霉亲和素上的链霉亲和素(SA)结合并快速催化DA转化为PDA，从而吸附Fe3+导致上清液的T2信号变化。该传感器通过金纳米颗粒、HCR反应以及PDA的三重信号放大，实现了pg级的分析检测，解决了传统磁弛豫时间传感器灵敏度低，稳定性差等问题。为达到上述目的，本专利技术使用了以下技术手段：一种三重信号放大磁弛豫传感免疫分析方法，包括以下步骤：1)在酶标板上包被待测物完全抗原并进行封闭；2)洗涤酶标板后加入待测物溶液和金纳米颗粒(AuNPs)，室温下进行免疫反应，所述金纳米颗粒上偶联有待测物单克隆抗体(Ab)和用于进行杂交链反应的引发链DNA(iDNA)；3)洗涤酶标板后加入生物素(bio)修饰的两个寡聚核苷酸DNA发夹(bio-H1和bio-H2)，室温下进行杂交链反应(HCR)；4)洗涤酶标板后加入链霉亲和素(SA)标记的辣根过氧化物酶(HRP)，室温下进行生物识别反应；5)洗涤酶标板后加入盐酸多巴胺(DA)，DA在辣根过氧化物酶(HRP)催化下生成聚多巴胺(PDA)；6)洗涤酶标板后加入Fe3+溶液，室温下进行吸附反应；7)取上清液，用低场核磁共振分析仪测定横向弛豫时间T2并对目标物进行定性和定量分析。本专利技术的检测原理如下：首先，通过构建Ab-AuNPs-iDNA探针，iDNA被AuNPs富集，实现了第一次信号倍增。竞争免疫后，不同数量的与酶标板结合的Ab-ANPs-iDNA引发HCR反应，HCR产物中的许多生物素可以通过生物素-链霉亲和素相互作用来富集更多的HRP-SA，以实现第二次信号倍增。HRP-SA的富集可将DA快速转换为PDA，以进行第三次信号增强。Fe3+通过与PDA形成配位键被吸附到酶标板底部时，上清液中的Fe3+数量大大减少，从而导致显著的T2信号变化值(ΔT2＝T2样品-T2空白)。ΔT2与目标物含量成正比，目标物越多，ΔT2值越大；反之，ΔT2值越小。优选地，所述引发链DNA的核苷酸序列为H2N-AAAAAAAAAAAAGTCTAGGATTCGGCGTGGGTTAA，所述两个生物素修饰的寡聚核苷酸DNA发夹的序列为bio-H1：biotin-TTAACCCACGCCGAATCCTAGACTCAAA；bio-H2：AGTCTAGGATTCGGCGTGGGTTAACACGCCGAATCCTAGACTACTTTG-biotin。所述金纳米颗粒上偶联的待测物单克隆抗体量为10-50μg，优选为30μg。所述金纳米颗粒上偶联的引发链DNA量为0.1-1nmol，优选为0.5nmol。所述生物素修饰的两个DNA发夹的浓度为0本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种三重信号放大磁弛豫传感免疫分析方法，其特征在于包括以下步骤：/n1)在酶标板上包被待测物完全抗原并进行封闭；/n2)洗涤酶标板后加入待测物溶液和金纳米颗粒，室温下进行免疫反应，所述金纳米颗粒上偶联有待测物单克隆抗体和用于进行杂交链反应的引发链DNA，/n3)洗涤酶标板后加入生物素修饰的两个寡聚核苷酸DNA发夹，室温下进行杂交链反应；/n4)洗涤酶标板后加入链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶，室温下进行生物识别反应；/n5)洗涤酶标板后加入盐酸多巴胺溶液，盐酸多巴胺在辣根过氧化物酶催化下生成聚多巴胺；/n6)洗涤酶标板后加入Fe

【技术特征摘要】
1.一种三重信号放大磁弛豫传感免疫分析方法，其特征在于包括以下步骤：
1)在酶标板上包被待测物完全抗原并进行封闭；
2)洗涤酶标板后加入待测物溶液和金纳米颗粒，室温下进行免疫反应，所述金纳米颗粒上偶联有待测物单克隆抗体和用于进行杂交链反应的引发链DNA，
3)洗涤酶标板后加入生物素修饰的两个寡聚核苷酸DNA发夹，室温下进行杂交链反应；
4)洗涤酶标板后加入链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶，室温下进行生物识别反应；
5)洗涤酶标板后加入盐酸多巴胺溶液，盐酸多巴胺在辣根过氧化物酶催化下生成聚多巴胺；
6)洗涤酶标板后加入Fe3+溶液，室温下进行吸附反应；
7)取上清液，用低场核磁共振分析仪测定横向弛豫时间T2并对目标物进行定性和定量分析。


2.如权利要求1所述的三重信号放大磁弛豫传感免疫分析方法，其特征在于：所述引发链DNA的核苷酸序列为H2N-AAAAAAAAAAAAGTCTAGGATTCGGCGTGGGTTAA，所述两个生物素修饰的寡聚核苷酸DNA发夹的序列为bio-H1：biotin-TTAACCCACGCCGAATCCTAGACTCAAA；bio-H2：AGTCTAGGATTCGGCGTGGGTT...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈翊平，赵彬杰，洪锋，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42