循序多重蛋白质印迹制造技术

本文描述了用于样品中靶标分析物循序多重检测的方法和组合物。所述方法包括将包含固定在固体支持物上的分析物的样品与特异性结合样品中分析物的结合剂接触，其中每种结合剂结合不同的分析物并连接至包含独特序列的单链核酸分子。然后样品与标记的互补核酸分子接触，该核酸分子结合与一种结合剂连接的单链核酸分子。来自标记物的信号被检测，然后减小或消除。样品可同时接触结合不同结合剂的第二标记的互补核酸分子并检测来自第二标记物的信号。重复该过程以检测样品中每种其他分析物，从而循序地检测样品中的分析物的存在。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】循序多重蛋白质印迹相关申请的交叉引用本申请要求2018年12月27日提交的美国临时专利申请号62/785,389的优先权，其内容通过引用全文纳入本文以用于所有目的。以ASCII文本文件提交的“序列表”、表格、或计算机程序表附页的引用将2019年12月17日于机器型号IBM-PC，MS-Windows操作系统创建的3,358字节的文件094260-1163921-116210PC_SL.TXT中所记载的序列表通过引用全文纳入本文用于所有目的。专利技术背景多重蛋白质印迹的现有方法具有有限的多重能力，因为它们需要不同物种的一抗，多种二抗，且用于检测抗体的荧光染料存在光谱重叠。剥离-重探测方法的缺点是长且冗杂，需要重新封闭和额外的长时间抗体孵育步骤来检测每种后续靶标，并且需要使用苛刻的试剂(去污剂、还原剂、低pH)和/或在循环之间加热，这样可以从膜的表面剥离靶标抗原。另外，使用多色检测需要昂贵的仪器，这会影响该方法的采用。本申请描述了现有试验的问题的解决方案。专利技术概述本文描述了用于循序地检测样品中靶标分析物的存在的方法和组合物。在一些实施方式中，靶标分析物固定于固体支持物上。一方面，该方法包括：i)使包含两种或更多固定在固体支持物上的分析物的样品与特异性结合样品中分析物的两种或更多结合剂接触，其中每种分析物特异性结合剂结合不同的分析物并连接至包含独特序列的单链核酸分子；ii)使样品与核酸分子接触，该核酸分子包含第一可检测标记物和具有互补区的序列，其与第一分析物特异性结合剂相连的独特序列结合；iii)检测来自第一可检测标记物的信号；iv)减小第一可检测标记物的信号；v)使样品与核酸分子接触，该核酸分子包含第二可检测标记物和具有互补区的序列，其与第二分析物特异性结合剂相连的独特序列结合；且vi)检测来自第二可检测标记物的信号；从而循序地检测两种或更多种分析物的存在。在一些实施方式中，该方法进一步包括为了固定于固体支持物上的其他靶标分析物重复步骤(iv)-(vi)。在一些实施方式中，步骤(iv)和(v)同时发生。在一些实施方式中，减小可检测标记物的信号包括猝灭、失活或去除信号或可检测标记物。在一些实施方式中，去除信号包括消化包含可检测标记物的核酸。在一些实施方式中消化涉及使用限制酶和/或DNA糖基化酶联合内切核酸酶VIII。在一些实施方式中，去除信号涉及包含可光裂解间隔子的核酸骨架的光解。在一些实施方式中，去除信号包括置换包含可检测标记物的核酸链。在一些实施方式中，置换核酸链包括使用具有链置换功能的聚合酶。在一些实施方式中，置换核酸链包括使用粘性末端(toehold)交换链置换，描述于Yurke，B等，2000，Nature406，p605-608和Zhang，DY及Winfree，E，2009，JAmChemSoc131，p17303-17314。在一些实施方式中，减小可检测标记物的信号不从固体支持物上去除靶标分析物。在一些实施方式中，第一和第二可检测标记物是相同的或不同的。在一些实施方式中，包含可检测标记物的核酸分子沿着至少部分的独特序列形成双链体。在一些实施方式中，单链核酸分子通过5’磷酸基、胺基、羧基、羟基、巯基、点击化学、铜(I)-催化的叠氮化物-炔环加成(CuAAC)、张力促进的叠氮化物-炔环加成(SPAAC)、张力促进的炔-硝酮环加成(SPANC)或接头与结合剂相连。在一些实施方式中，结合剂上的碳水化合物氧化之后，通过还原性胺化连接单链核酸分子。在一些实施方式中，用于连接单链核酸的接头包括生物素、链霉亲和素、蛋白A、蛋白G、蛋白A/G或蛋白L。在一些实施方式中，结合剂包括抗体或其抗原结合片段、纳米抗体、亲和抗体或其他抗体模拟物、适体、受体、配体、肽、凝集素、核酸分子或小分子。另一方面，描述了用于循序地检测样品中两种或更多种靶标分析物的存在的方法。在一些实施方式中，靶标分析物固定于固体支持物上。在一些实施方式中，在一个夹心型试验方式中，靶标分析物通过特异性结合靶标分析物的结合剂(例如抗体)与固体支持物相连。一些实施方式中，所述方法包括：i)使包含有至少两种不同靶标分析物固定其上的固体支持物与至少特异性结合样品中的第一种靶标分析物的第一结合剂和至少特异性结合样品中的第二种靶标分析物的第二结合剂接触，其中第一分析物特异性结合剂与包含独特序列的第一核酸分子相连，第二分析物特异性结合剂与包含独特序列的第二核酸分子相连；ii)使第一核酸分子与包含第一可检测标记物的核酸分子及结合第一核酸分子的序列接触；iii)检测来自第一可检测标记物的信号；iv)减小第一可检测标记物的信号；v)使第二核酸分子与包含第二可检测标记物的核酸分子及结合第二核酸分子的序列接触；且vi)检测来自第二可检测标记物的信号；从而循序地检测样品中的不同靶标分析物。在一些实施方式中，第一和第二核酸分子是单链的。在一些实施方式中，结合第一核酸分子的序列与第一核酸分子的独特序列区域互补，结合第二核酸分子的序列与第二核酸分子的独特序列区域互补。在一些实施方式中，包含第一可检测标记物的核酸分子沿着至少部分的第一核酸分子形成双链体，包含第二可检测标记物的核酸分子沿着至少部分的第二核酸分子形成双链体。在一些实施方式中，第一和第二可检测标记物是相同的或不同的。在一些实施方式中，该方法包括为了固定于固体支持物上的其他靶标分析物重复步骤(iv)-(vi)。在一些实施方式中，减小可检测标记物的信号包括猝灭、失活或去除信号或可检测标记物。在一些实施方式中，去除信号包括消化包含可检测标记物的核酸。在一些实施方式中消化涉及使用限制酶和/或DNA糖基化酶联合内切核酸酶VIII。在一些实施方式中，去除信号涉及包含可光裂解间隔子的核酸骨架的光解。在一些实施方式中，去除信号包括置换包含可检测标记物的核酸链。在一些实施方式中，置换核酸链包括使用具有链置换功能的聚合酶。在一些实施方式中，置换核酸链包含使用粘性末端交换链置换。在一些实施方式中，包含可检测标记物的核酸分子沿着至少部分的第一核酸分子、第二核酸分子或两者形成双链体。在一些实施方式中，第一核酸分子、第二核酸分子或两者通过5’磷酸基、胺基、羧基、羟基、巯基、点击化学、铜(I)-催化的叠氮化物-炔环加成(CuAAC)、张力促进的叠氮化物-炔环加成(SPAAC)、张力促进的炔-硝酮环加成(SPANC)或接头与结合剂相连。在一些实施方式中，在结合剂上的碳水化合物氧化之后，通过还原性胺化连接单链核酸分子。在一些实施方式中，用于连接单链核酸的接头包括生物素、链霉亲和素、蛋白A、蛋白G、蛋白A/G或蛋白L。在一些实施方式中，包含独特序列的核酸分子可通过两种或更多种特异性且稳定相连的分子之间相互作用共价或非共价地连接至结合剂。在一些实施方式中，结合剂包括抗体或其抗原结合片段、纳米抗体、亲和抗体或其他抗体模拟物、适体、受体、配体、肽、凝集本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于循序地检测样品中靶标分析物的存在的方法，其包括：/ni)将包含固定在固体支持物上的两种或更多分析物的样品与特异性结合样品中分析物的两种或更多结合剂接触，其中每种分析物特异性结合剂结合不同的分析物并连接至包含独特序列的单链核酸分子；/nii)使样品和核酸分子接触，所述核酸分子包含第一可检测标记物和具有互补区的序列，其与第一分析物特异性结合剂相连的所述独特序列结合；/niii)检测来自第一可检测标记物的信号；/niv)减小所述第一可检测标记物的所述信号；/nv)使所述样品与核酸分子接触，所述核酸分子包含第二可检测标记物和具有互补区的序列，其与第二分析物特异性结合剂相连的独特序列结合；且/nvi)检测来自第二可检测标记物的信号，/n从而循序地检测两种或更多分析物的存在。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20181227 US 62/785,3891.一种用于循序地检测样品中靶标分析物的存在的方法，其包括：
i)将包含固定在固体支持物上的两种或更多分析物的样品与特异性结合样品中分析物的两种或更多结合剂接触，其中每种分析物特异性结合剂结合不同的分析物并连接至包含独特序列的单链核酸分子；
ii)使样品和核酸分子接触，所述核酸分子包含第一可检测标记物和具有互补区的序列，其与第一分析物特异性结合剂相连的所述独特序列结合；
iii)检测来自第一可检测标记物的信号；
iv)减小所述第一可检测标记物的所述信号；
v)使所述样品与核酸分子接触，所述核酸分子包含第二可检测标记物和具有互补区的序列，其与第二分析物特异性结合剂相连的独特序列结合；且
vi)检测来自第二可检测标记物的信号，
从而循序地检测两种或更多分析物的存在。


2.如权利要求1所述的方法，其进一步包括为了固定于所述固体支持物上的各其他靶标分析物重复步骤(iv)-(vi)。


3.如权利要求1所述的方法，其中步骤(iv)和步骤(v)同时发生。


4.如权利要求1所述的方法，其中减小所述可检测标记物的所述信号包括猝灭、失活或去除所述信号或可检测标记物。


5.如权利要求4所述的方法，其中所述去除包括消化所述包含所述可检测标记物的核酸。


6.如权利要求4所述的方法，其中所述去除包括使用粘性末端探针或聚合酶活性的链置换。


7.如权利要求4所述的方法，其中减小所述可检测标记物的所述信号不从所述固体支持物上去除靶标分析物。


8.如权利要求1所述的方法，其中所述第一和第二可检测标记物是相同或不同的。


9.如权利要求1所述的方法，其中所述包含所述可检测标记物的核酸分子沿着至少部分的所述独特序列形成双链体。


10.如权利要求1所述的方法，其中所述单链核酸分子通过5’磷酸基、胺基、羧基、羟基、巯基、点击化学、铜(I)-催化的叠氮化物-炔环加成(CuAAC)、张力促进的叠氮化物-炔环加成(SPAAC)、张力促进的炔-硝酮环加成(SPANC)或接头与所述结合剂相连。


11.如权利要求10所述的方法，其中所述接头包括生物素、链霉亲和素、蛋白A、蛋白G、蛋白A/G或蛋白L。


12.如权利要求1所述的方法，其中所述结合剂包括抗体或其抗原结合片段、适配体、受体、配体、肽或小分子。


13.一种用于循序地检测样品中两种或更多种靶标分析物的存在的方法，其包括：
i)使包含有至少两种不同靶标分析物固定其上的固体支持物与至少特异性结合样品中的第一种靶标分析物的第一结合剂和至少特异性结合样品中的第二靶标分析物的第二结合剂接触，其中所述第一分析物特异性结合剂与包含独特序列的第一核酸分子相连，所述第二分析物特异性结合剂与包含独特序列的第二核酸分子相连；
ii)使所述第一核酸分子与包含第一可检测标记物的核酸分子及结合所述第一核酸分子的序列接触；
iii)检测来自所述第一可检测标记物的信号；
iv)减小所述第一可检测标记物的所述信号；
v)使所述第二核酸分子与包含第二可检测标记物的核酸分子及结合所述第二核酸分子的序列接触；且
vi)检测来自所述第二可检测标记物的信号；
从而循序地检测样品中的不同靶标分析物。


14.如权利要求13所述的方法，其中所述第一和第二核酸分子是单链的。

【专利技术属性】
技术研发人员：W·斯特朗，E·赫夫纳，
申请(专利权)人：生物辐射实验室股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US