VDAC1突变基因、检测其的引物、试剂盒和方法以及其用途技术

本发明专利技术涉及与LIMD相关的VDAC1突变基因、检测其的引物、试剂盒和方法以及其用途，突变VDAC1基因与人类基因组参考序列GRCh37相比具有以下突变中的一种：5号染色体物理位置为133326788的碱基由C突变为A、5号染色体物理位置为133316511的碱基由G突变为A；突变VDAC1基因的cDNA序列与SEQ ID NO.1的序列相比具有如下突变中的一种：c.175G>T、c.460C>T；突变VDAC1蛋白的序列与SEQ ID NO.2的序列相比具有以下突变中的一种：p.Glu59Ter、p.Gln154Ter。本发明专利技术为LIMD的早期分子筛查、家族遗传研究提供了重要的依据。

【技术实现步骤摘要】
VDAC1突变基因、检测其的引物、试剂盒和方法以及其用途
本专利技术涉及疾病相关突变基因，具体涉及VDAC1突变基因、检测其的引物、试剂盒和方法以及其用途。
技术介绍
在所有遗传性代谢疾病中，线粒体疾病的发病率最高。线粒体主要负责氧化磷酸化产生三磷酸腺苷。线粒体疾病的发病机制涉及两种不同的基因组：核基因组和母体遗传的16.6kb线粒体基因组。线粒体疾病可由这些基因组中的任何一个突变引起的。核DNA(nDNA)的缺陷会导致诸如呼吸链复杂结构、翻译和线粒体DNA(mtDNA)修复缺陷等问题。在儿童时期诊断的线粒体疾病中，大约25％是由于线粒体DNA异常引起的，而其余75％是由于nDNA缺陷引起的。严重的新生儿或婴儿起病的线粒体疾病通常会导致出生后一年内死亡，婴儿致死性线粒体疾病(lethalinfantilemitochondrialdisease,LIMD)约占儿童期起病线粒体疾病病例的8.5％，但LIMD的分子遗传诊断率很低，大多数LIMD病例是在受试者死亡后通过生物化学和遗传方法才得到诊断。因此，当父母再次怀孕时，这类新生儿发病的严重线粒体疾病由于诊断不及时，还有可能再次发生。虽然已发现近千种核基因组基因与线粒体的功能有关，仅仅有少部分确定与LIMD的发生有关，提示存在新的LIMD致病基因有待挖掘。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种与婴儿致死性线粒体疾病有关的VDAC1突变基因、检测其的引物、试剂盒和方法以及其用途。本专利技术的目的通过如下技术方案实现：一种突变VDAC1基因或突变VDAC1蛋白，所述突变VDAC1基因与人类基因组参考序列GRCh37相比具有以下突变中的至少一种：5号染色体物理位置为133326788的碱基由C突变为A、5号染色体物理位置为133316511的碱基由G突变为A；所述突变VDAC1基因的cDNA序列与SEQIDNO.1的序列相比具有如下突变中的至少一种：c.175G>T、c.460C>T；所述突变VDAC1蛋白的序列与SEQIDNO.2的序列相比具有以下突变中的至少一种：p.Glu59Ter(59位谷氨酸突变为终止密码子)、p.Gln154Ter(154位谷氨酰胺突变为终止密码子)。VOLTAGE-DEPENDENTANIONCHANNEL1(电压依赖性阴离子通道1，VDAC1)基因位于5号染色体5q31.1位置，该基因含有9个外显子，其编码的VDAC1蛋白有283个氨基酸，分子量约为31KDa。VDAC1是线粒体外膜和细胞膜的通道分子。该通道允许亲水小分子扩散通过线粒体外膜；在细胞膜中，它参与细胞体积调节和细胞凋亡。VDAC1可以结合各种信号分子，包括鞘脂神经酰胺、磷脂磷脂酰胆碱和固醇胆固醇。在去极化线粒体中，作用于PRKN和PINK1的下游，促进线粒体吞噬或防止细胞凋亡。VDAC1参与通透性过渡孔复合体(PTPC)的形成，该复合物负责释放引发细胞凋亡的线粒体产物，VDAC1介导ATP从细胞的输出。目前VDAC1与疾病的相关性未见报道。野生型VDAC1基因在Ensemble数据库(www.ensembl.org)中的基因编码为ENSG00000213585，该基因位于5号染色体。专利技术人在大量正常人和LIMD患者家系中利用遗传学研究筛选发现VDAC1基因发生基因突变可以导致婴儿致死性线粒体疾病。本专利技术提供了新的致病基因的致病突变位点，为该疾病的早期分子筛查提供了新的分子生物学基础。上述第一种突变、第二种突变均位于翻译区，其中第一种突变的物理位置为133326788，碱基C突变为A；RNA水平：VDAC1基因的cDNA序列第175位碱基由G突变为T；蛋白水平：VDAC1基因编码蛋白第59位氨基酸由谷氨酸突变为终止密码子。第二种突变的物理位置为133316511，碱基由G突变为A，RNA水平：VDAC1基因的cDNA序列第460位碱基由C突变为T；蛋白水平：VDAC1基因编码蛋白第154位氨基酸由谷氨酰胺突变为终止密码子。一种检测突变VDAC1基因或突变VDAC1蛋白的方法，所述方法用于非诊断目的，所述方法包括检测VDAC1基因或VDAC1蛋白中是否存在突变位点；突变位点为如下至少一种：Chr5(GRCh37):g.133326788C>A，cDNA序列发生c.175G>T，p.Glu59Ter(59位谷氨酸突变为终止密码子)；Chr5(GRCh37):g.133316511G>A，cDNA序列发生c.460C>T，p.Gln154Ter(154位谷氨酰胺突变为终止密码子)。在一些实施方案中，本专利技术中所述的非诊断疾病的目的包括但不限于研究SNP分布和多肽性，用于家族演化研究。这样的应用是本领域技术人员可以理解的。有些个体携带本专利技术的突变VDAC1基因但不患LIMD，例如仅一条染色体携带所述突变的杂合基因型。对这部分人群的检测可以不涉及任何诊断疾病的目的，因为这些个体本身并不患病。但对于他们进行检测的结果可以作为有用的信息使用，例如作为育前检查的重要指标，指导生育，或者用于突变携带者筛查，或者作为SNP分布和多态性研究的工具或者追踪基因突变或家族演化。这样的应用也是本领域技术人员可以理解的。因此，本专利技术提供的检测突变VDAC1基因或突变VDAC1蛋白的方法涉及检测杂合突变。但本专利技术提供的检测突变VDAC1基因或突变VDAC1蛋白的方法也包括检测纯合突变。在本专利技术应用较佳的实施方式中，上述检测突变VDAC1基因或突变VDAC1蛋白的方法包括利用如下至少一组引物进行PCR扩增的步骤：VDAC1_E3F:GAGCCAGGATGGAAGGGAGAT(SEQIDNO:3)和VDAC1_E3R:GAAGGTCAGCTTCAGTCCACG(SEQIDNO:4)；VDAC1_E5F:CCTGTGTAGGCTGCTACGTT(SEQIDNO:5)和VDAC1_E5R:CAGGCCATGTGGCTCATCTAA(SEQIDNO:6)。在本专利技术应用较佳的实施方式中，上述采用引物进行扩增的PCR反应程序包括：94-100℃，1-10min；94-95℃，3-5min，95-96℃，25-30s，58-60℃，25-30s，循环30-40次，70-72℃，1-10min。检测突变VDAC1基因的方法包括如下步骤：(1)建立LIMD患者家系临床与遗传资源库，收集LIMD家系的临床信息与血液样本，提取基因组DNA；(2)设计覆盖VDAC1基因全外显子序列的扩增和测序引物进行测序；(3)比对正常人和LIMD患者家系样本的测序结果。在其中一种实施方式中，上述序列测定是Sanger序列测定。在其他实施方式中，上述检测突变VDAC1基因的方法还可以选自如下的技术进行：电泳、核酸杂交、原位杂交、PCR、逆转录酶链反应和变性高效液相色谱。在其他实施方式中，还涉及检测V本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种突变VDAC1基因或突变VDAC1蛋白，其特征在于：所述突变VDAC1基因与人类基因组参考序列GRCh37相比具有以下突变中的至少一种：/n5号染色体物理位置为133326788的碱基由C突变为A、5号染色体物理位置为133316511的碱基由G突变为A；/n所述突变VDAC1基因的cDNA序列与SEQ ID NO.1的序列相比具有如下突变中的至少一种：/nc.175G>T、c.460C>T；/n所述突变VDAC1蛋白的序列与SEQ ID NO.2的序列相比具有以下突变中的至少一种：/np.Glu59Ter、p.Gln154Ter。/n

【技术特征摘要】
1.一种突变VDAC1基因或突变VDAC1蛋白，其特征在于：所述突变VDAC1基因与人类基因组参考序列GRCh37相比具有以下突变中的至少一种：
5号染色体物理位置为133326788的碱基由C突变为A、5号染色体物理位置为133316511的碱基由G突变为A；
所述突变VDAC1基因的cDNA序列与SEQIDNO.1的序列相比具有如下突变中的至少一种：
c.175G>T、c.460C>T；
所述突变VDAC1蛋白的序列与SEQIDNO.2的序列相比具有以下突变中的至少一种：
p.Glu59Ter、p.Gln154Ter。


2.一种检测权利要求1所述的突变VDAC1基因或突变VDAC1蛋白的方法，所述方法用于非诊断目的，其特征在于：所述方法包括检测VDAC1基因或VDAC1蛋白中是否存在突变位点，所述突变位点为如下至少一种：
Chr5(GRCh37):g.133326788C>A，cDNA序列发生c.175G>T，p.Glu59Ter；
Chr5(GRCh37):g.133316511G>A，cDNA序列发生c.460C>T，p.Gln154Ter。


3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述方法包括利用如下至少一组引物进行PCR扩增的步骤：
SEQIDNO:3和SEQIDNO:4；
SEQIDNO:5和SEQIDNO:6。


4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述PCR扩增反应程序包括：94-100℃，1-10min；94-95℃，3-5min，95-96℃，25-30s，58-60℃，25-30s，循环30-40次，70-72℃，1-10min。


5.一种检测突变VDAC1基因的试剂，其特征在于：所述试剂为核酸检测探针或引物；
所述核酸检测探针与突变...

【专利技术属性】
技术研发人员：王开宇，马鑫瑞，
申请(专利权)人：福州福瑞医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：福建;35