用于选择生物结合分子的方法技术

本发明专利技术涉及制备、识别和选择生物结合分子的领域，尤其如选择性地结合到体细胞超突变的B细胞受体或B细胞受体复合物上的抗体或其片段。所述方法用于选择生物结合分子，所述结合分子特异地结合到作为靶受体的具有超突变区域的B细胞受体上、但是不结合到没有超突变区域的B细胞受体上，并且所述方法在基于细胞的系统的范围内在使用未成熟B细胞的情况下进行，所述未成熟B细胞处于祖阶段/前阶段，并且具有RAG2或RAG1、Lambda5和SLP65基因的“三重敲除”。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于选择生物结合分子的方法
本专利技术涉及制备、识别和选择生物结合分子的领域，尤其如选择性地结合到体细胞超突变的B细胞受体或B细胞受体复合物上的抗体或其片段。
技术介绍
在生化中，如果蛋白质或蛋白质复合物上结合有能够通过细胞内部中的结合事件来触发信号过程的信号分子，则该蛋白质或蛋白质复合物被称为受体(拉丁语为recipere，意为“接纳”或“接收”)。受体可以从外部接收信号，并且位于生物膜的表面处，或者可以在细胞溶质中检测到受体。受体具有用于其生理激动剂或拮抗剂(结合配对物、配体)的特异结合位点。膜受体位于生物膜的表面处，并且由常常被改性(例如碳水化合物链)的蛋白质组成。它们具有用于小分子(所谓的配体)或者用于较大分子的结合到受体结构的部分的特定通过形状，其方式为这些小分子或部分作为互补结构来补充受体结构(简称为“锁-钥匙原理”)。受体由此可以用于接纳和传导信号(信号传导)或者在功能上参与将细胞固定在一起(细胞粘附)或将物质传输到细胞中(膜传输)。另外，受体可以为病毒粒子提供贴靠在配合的宿主细胞处并感染宿主细胞的可能性。对于细胞接触而言重要的膜受体不仅包括介导细胞-细胞接触的细胞粘附分子，如钙粘附蛋白、选择素(Selectine)和免疫球蛋白，而且还包括参与形成细胞-基质接触和将细胞锚固在细胞外基质上的那些细胞粘附分子，如整合素(Integrine)。膜受体不仅出现在细胞质膜上，而且还出现在细胞内部中的细胞器的生物膜上。虽然位于外部的细胞膜受体将细胞与作为细胞环境的外部空间相关联，但是在细胞内部中单独的细胞器经由受体与细胞质、细胞骨架相关联或者彼此相关联。在细胞膜内的受体根据其作用方式被细分成离子型和代谢型受体。离子型受体形成离子通道，这些离子通道在结合适合的配体时以较高几率打开并且由此改变膜的传导性。相反，代谢型受体不形成通道或孔，而是在结合其配体时将下游的“第二信使”(例如G蛋白或蛋白激酶)活化并且由此通过第二信使物质的浓度变化来调制细胞内的信号级联，这虽然是间接的但是也可以导致膜透过性的变化。对于许多受体而言，存在天然的配体，这些配体导致这些受体的活化并且触发“第二信使”级联。除了天然的配体之外，还存在结合到受体上并且使其活化(激动剂)或失活(拮抗剂)的物质。受体激动剂的例子例如为抗原，包括过敏原、阿片类药物、尼古丁、沙丁胺醇、毒蕈碱、细胞因子和神经递质。在此方面特殊的受体为B细胞受体或B细胞受体复合物(BCR)。这种BCR被B细胞表达并且几乎形成了与膜绑定的抗体。在成熟的B细胞中形成有各种各样的BCR。这种BCR一般为IgD型或IgM型。在人类中以及还有在若干其他哺乳动物中，B细胞的发育在骨髓中或在胎儿肝脏中进行。正在发育的淋巴细胞从所谓的基质细胞获得发育程序所需的信号。在B细胞发育时，形成起作用的B细胞受体(“抗体”的与膜绑定的形式)具有决定性意义。只有利用这种抗原受体，成熟的B细胞稍后才能识别陌生的抗原并且通过形成对应的抗体来结合到敌对结构上。受体的抗原特异性通过连接特定的基因片段来确定。这些段称为V片段、D片段和J片段，因此该过程被称为V(D)J重组。在此，构成B细胞受体的结合抗原的部分的这些片段被重排。整个受体由两个相同的轻蛋白链和两个相同的重蛋白链组成，其中重链与轻链分别经由二硫桥键彼此连接。在VDJ重组时，首先将B细胞受体的重链的V片段、D片段和J片段连接，然后将轻受体链的V片段和J片段连接。只有在基因被成功重排时(被称为有效基因重排)时，细胞才可以转到相应的下一个发育步骤中。在其在骨髓中的成熟过程期间对身体自身的抗原做出反应的B细胞在大多数情况下由于细胞凋亡而死亡。在健康人的血液中可以检测到少量的自身反应性细胞，尤其针对甲状腺球蛋白或胶原蛋白(AbulK.Abbas:DiseasesofImmunityinVinayKumar,AbulK.Abbas,NelsonFausto:RobbinsandCotran-PathologicBasisofDisease.第7版.Philadelphia2005,第224页起)。将突变引入到成熟的B细胞的抗体基因中被称为体细胞超突变。这个事件在卵泡B细胞中发生。体细胞超突变是B细胞要到达亲和力成熟状态所经历的过程。它是适应性免疫系统的一个重要步骤。借助于酶“活化诱导的胞苷脱氨酶”(AID或也称AICDA)产生了对DNA的随机改变。AID将胞嘧啶在单链DNA中脱氨成尿苷。酶UNG去除尿嘧啶并且创造脱碱基位点。在那里由APE1产生单链断裂。结果以此方式激活了细胞内部的修复机制，然后通过该修复机制在修复时随机加入序列变化。然后这可能在氨基酸层面上导致结构变化且由此有条件地导致B细胞受体(BCR)的亲和性变化。当通过目前为止尚不清楚的机制使对抗原的亲和性达到特定强度时，这个过程结束。通过选择，选出了最佳地结合抗原并且由此可以最有效地对抗抗原的那些细胞。其余的细胞则消亡。在次级淋巴器官(脾脏、淋巴结)的生发中心中进行的这个过程允许生物体产生大量不同的抗体，并且由此匹配于在免疫逃避过程中变化的病原体并且提高抗体对抗原的亲和性。这个步骤导致产生单一类型的B细胞群落，这些群落一般为单克隆或寡克隆的。如果此类群落参与了在自身免疫或恶性背景下的发病(无论是肈因性的还是辅助性的)，则可以通过从体内去除这些细胞来正面影响发病，其方式为使致病症状减少或完全消失。为了从体内选择性地去除这些B细胞，需要极具特异性的抗体。然后这些抗体例如可以作为基于膜的受体、作为嵌合受体的一部分(例如借助于CAR-T细胞)或者作为治疗用抗体以可溶形式使用。另一种应用形式是预治疗用的血浆净化法，其中与基质绑定的抗体被用于将恶性细胞从血液中分离。患者的肿瘤负荷可能由此显著降低，并且于是免疫系统在较低程度上承受由于剩余细胞的死亡造成的负担。去除这些特定的B细胞导致免疫系统不会像所有B细胞死亡时那样完全瘫痪并且丧失此前的免疫性(例如在感染或接种疫苗之后)，而是即使受到治疗患者仍然具有继续可用的免疫系统。为了生成针对受体的抗体，一般将这些受体的可溶形式(以重组且经纯化的形式)用于对小鼠进行免疫。在少见的情况下还可以使用肽片段。借助于杂交瘤技术，由小鼠中产生的特定B细胞创造了产生抗体的杂交瘤细胞。这些杂交瘤细胞产生抗体，然后借助于ELISA或借助于所表达的受体在细胞系统中测试这些抗体。为此使用常规方式建立的细胞系，因为只有这些细胞系能够以简单方式得以培养。在此可以产生相对特异性地结合至某一受体类型(例如抗IgGI、抗IgE)的抗体。然而在此通常产生与其他受体或其他表位的交叉反应。对于BCR抗体的治疗用途而言，总体上仅使用一种针对BCR的抗体在大多数情况下是不足的，因为如此的大范围使用可能触发严重的副作用。相反，值得期望的是，提供一种选择性结合到受体上的抗体，该受体具有活化作用、尤其例如不希望的(病理生理学的或自主的)活化作用。此类抗体在现有技术中是未知的，并且不存在用于制备或通过选择获得该抗体的方法。...

【技术保护点】
1.一种用于选择生物结合分子的方法，所述生物结合分子在基于细胞的系统的范围内在使用处于祖阶段/前阶段的未成熟B细胞的情况下特异性地结合到作为靶受体的体细胞超突变的B细胞受体上而不结合到同源非超突变的B细胞受体上，所述方法包括以下步骤：/n(a)提供多个生物结合分子，所述生物结合分子通过利用B细胞受体或其片段使哺乳动物免疫以及随后无限增殖和纯化而获得；/n(b)提供处于祖阶段/前阶段的未成熟B细胞，所述未成熟B细胞不能表达RAG2和/或RAG1以及Lambda5的内源基因，但是能够在其细胞表面上表达体细胞超突变的B细胞受体作为靶受体；/n(c)提供处于祖阶段/前阶段的未成熟B细胞，所述未成熟B细胞不能表达RAG2和/或RAG1以及Lambda5的内源基因，但是能够在其细胞表面上表达重组制备的B细胞受体作为参考受体，所述重组制备的B细胞受体与根据(b)的受体相比是同源的受体、但不是具有超突变区域的受体；/n(d)对比研究根据步骤(a)提供的结合分子对于根据步骤(b)和(c)提供的细胞的结合行为；/n(e)选择特异性地结合到根据步骤(b)提供的细胞上、但不结合到根据步骤(c)提供的细胞上的至少一种结合分子。/n...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20181220 EP 18000989.61.一种用于选择生物结合分子的方法，所述生物结合分子在基于细胞的系统的范围内在使用处于祖阶段/前阶段的未成熟B细胞的情况下特异性地结合到作为靶受体的体细胞超突变的B细胞受体上而不结合到同源非超突变的B细胞受体上，所述方法包括以下步骤：
(a)提供多个生物结合分子，所述生物结合分子通过利用B细胞受体或其片段使哺乳动物免疫以及随后无限增殖和纯化而获得；
(b)提供处于祖阶段/前阶段的未成熟B细胞，所述未成熟B细胞不能表达RAG2和/或RAG1以及Lambda5的内源基因，但是能够在其细胞表面上表达体细胞超突变的B细胞受体作为靶受体；
(c)提供处于祖阶段/前阶段的未成熟B细胞，所述未成熟B细胞不能表达RAG2和/或RAG1以及Lambda5的内源基因，但是能够在其细胞表面上表达重组制备的B细胞受体作为参考受体，所述重组制备的B细胞受体与根据(b)的受体相比是同源的受体、但不是具有超突变区域的受体；
(d)对比研究根据步骤(...

【专利技术属性】
技术研发人员：H·克洛夫特，M·杜伦冯·明登，
申请(专利权)人：阿瓦生命科学有限公司，
类型：发明
国别省市：德国;DE