一种编码rPD蛋白的核酸、其制备方法和用途技术

本发明专利技术公开了一种编码rPD蛋白的分离的核酸、其制备方法和用途，所述分离的核酸的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示，利用所述分离的核酸表达rPD蛋白的表达量高。通过本发明专利技术制造的rPD蛋白具有耗时短、低成本、纯度高、收率高、工艺稳定性强等特点，在rPD蛋白制备的领域具有极为广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种编码rPD蛋白的核酸、其制备方法和用途
本专利技术涉及利用基因工程技术生产重组蛋白药物，具体涉及流感嗜血杆菌D蛋白的可溶性高表达和纯化方法，属于基因工程技术和医药

技术介绍
流感嗜血杆菌(haemophilusinfluenzae，Hi)可引起人类多种传染性疾病，最常见和最严重的是脑膜炎，其次是肺炎。根据其主要的毒力因子——荚膜的有无，可将其分为两大类有荚膜型和无荚膜型。有荚膜型有a、b、c、d、e、f六个荚膜型别，无荚膜型别为不可分型(Nontypeablehaemophilusinfluenzae,NTHi)。六种荚膜型别中，b型致病力最强，是引起小儿严重细菌感染的主要致病菌，其感染对象主要是5岁以下婴幼儿，占所有Hi侵袭性感染的95％。在将Hib荚膜多糖结合疫苗纳入儿童免疫计划后，侵入性Hib感染率发生了显著的下降。近年来，有研究报道，NTHi逐渐替代荚膜型成为临床优势感染菌株，这些菌株经常是造成儿童急性中耳炎(AOM)的原因。ProteinD(PD)是一种相对分子量为42KDa的表面脂蛋白，存在于所有的Hi和NTHi中，基因序列具有高度的保守性。天然PD由364个氨基酸编码，其中1-18位氨基酸为信号肽序列，19-364位氨基酸为成熟肽序列。PD作为外膜脂蛋白是通过脂肪酸与PD成熟肽的首位半胱氨酸通过脂酰化作用而连接，缺乏半胱氨酸的PD突变体不能得到酰化而被分泌到胞内。作为Hi的一种特征性毒力决定因子，PD在Hi引起呼吸道感染过程中起重要作用，是极具潜力的疫苗候选蛋白。早在2009年，非酰化NTHiPD就作为10价疫苗(PHiD-CV,SynflorixTM)的载体蛋白在欧洲上市，具有较好的安全性和有效性，对肺炎链球菌引起的中耳炎和NTHi引起的急性中耳炎起到了有效预防。表明PD作为一种新型的载体蛋白，在今后的疫苗应用中具有广阔前景。美国专利US9,107,872简略描述了PD的构建表达及纯化，其采用的是传统的PL和PR温敏表达系统，在升温诱导的过程中会刺激宿主菌的水解酶的表达，影响重组蛋白的稳定性，且在放大生产中升温过程耗时长，难以做到产业化放大。关于PD蛋白的重组表达研究相对较少，现有的文献均采用从细菌基因组上扩增pd基因的方法，尹梦梦在氨苄抗性的大肠杆菌中实现了PD蛋白的可溶性表达，破碎上清中PD蛋白占全菌体蛋白的44％(尹梦梦.b型流感嗜血杆菌多糖制备工艺及其D蛋白原核可溶性表达研究[D].北京协和医学院,2013.)。杜倩成功构建了pET30a-PD表达株，以包涵体形式表达，PD表达量占全菌体蛋白40％(杜倩.b型流感嗜血杆菌D蛋白的克隆,表达,纯化及作为结合疫苗载体的初步研究[D].暨南大学,2011.)。实现高效可溶且无标签表达的菌种是理想的工业菌种，目前尚未见有关重组ProteinD(rPD)蛋白高效可溶表达及相关生产工艺的报道。
技术实现思路
为了解决上述问题，实现低成本、高收率、高纯度、易放大的rPD蛋白制备方法，本专利技术提供了一种编码rPD蛋白的核酸、其制备方法和用途。本专利技术通过对大肠杆菌的密码子优化并进行化学合成，优化不仅仅是简单的将密码子向大肠杆菌偏好高的方向进行替换，而是通过部分替换并进行化学合成，最终获得高效可溶性表达、无标签的rPD表达株。经纯化后获得的高纯度、低内毒素rPD可用于载体蛋白或疫苗组分使用。为解决上述技术问题，本专利技术的技术方案之一为：提供一种编码rPD蛋白的分离的核酸，所述分离的核酸的核苷酸序列如SEQIDNo:1所示。为解决上述技术问题，本专利技术的技术方案之二为：提供一种表达载体，所述表达载体包含如技术方案之一所述的分离的核酸。在一具体实施例中，所述表达载体为pET27b或pET30a。优选地，所述载体为pET30a。为解决上述技术问题，本专利技术的技术方案之三为：提供一种表达菌株，所述表达菌株包含如技术方案之一所述的分离的核酸，或如技术方案之二所述的表达载体。在一具体实施例中，所述表达菌株的宿主菌为大肠杆菌。优选地，所述菌株为BL21(DE3)。为解决上述技术问题，本专利技术的技术方案之四为：提供一种rPD蛋白的发酵工艺，培养如技术方案之三所述的表达菌株，获得发酵液；所述发酵工艺的发酵温度例如为32～37℃，所述发酵液的A600nm值例如为10左右时，添加诱导剂；诱导剂为IPTG，诱导温度例如为16～28℃，诱导时长例如为4h～12h。优选地，所述诱导温度为28℃，所述IPTG的终浓度为0.05～0.5mmol/L。为解决上述技术问题，本专利技术的技术方案之五为：提供一种rPD蛋白的粗处理方法，所述粗处理方法包含利用精氨酸对如技术方案之四所述的发酵工艺获得的发酵液进行高渗处理，以获得rPD蛋白溶液。优选地，所述高渗处理使用精氨酸进行，且随后进行低渗处理。更优选地，所述粗处理方法包括以下步骤：(1)将所述发酵液进行超滤浓缩，收集菌体浓缩液；(2)在所述菌体浓缩液中加入精氨酸，室温搅拌例如3h，形成高渗处理液；(3)将所述高渗处理液按照1:10体积比例与低渗液混合，室温静置例如静置过夜或静置12小时以上，获得混合液；(4)将所述混合液进行澄清，收集澄清流穿液；(5)将所述澄清流穿液进行浓缩，收集浓缩截留液；(6)将所述浓缩截留液使用置换液进行置换，优选置换3～4次，获得浓缩置换液。进一步更优选地，使用0.45μm、10Kda～30Kda的膜包进行超滤浓缩和/或澄清，和/或，所述高渗处理液中精氨酸的终浓度为0.5mol/L；和/或，所述菌体浓缩液中菌体浓度为0.3g菌体/mL；和/或，所述低渗液为50mmol/LTris-HCl、pH8.0、含1mmol/LEDTA；和/或，所述置换液为50mmol/LPBS缓冲液、pH6.5、含1mmol/LEDTA。为解决上述技术问题，本专利技术的技术方案之六为：提供一种rPD蛋白的纯化方法，所述纯化方法包括以下步骤：(1)将如技术方案之五所述的粗处理方法得到的浓缩置换液上样于经平衡后的阴离子交换柱，冲洗、流穿后收集上样流穿液和冲洗流穿液，所述阴离子交换柱的填料例如为DEAESepharoseFF；优选所述平衡使用3倍柱体积的平衡液，和/或，所述冲洗使用3倍柱体积的冲洗液；和/或，(2)将所述上样流穿液和冲洗流穿液合并上样于经平衡后的阳离子交换柱，冲洗、流穿后使用洗脱缓冲液进行洗脱，收集洗脱液，所述阳离子交换柱的填料例如为SPSepharoseFF；优选所述平衡使用3倍柱体积的平衡液，和/或，所述冲洗使用3倍柱体积的冲洗液，和/或，所述洗脱使用3倍柱体积的洗脱缓冲液。较佳地，所述阴离子交换柱的平衡液和冲洗液均为50mmol/LPBS，pH6.5，含1mmol/LEDTA；和/或，所述阳离子交换柱的平衡液和冲洗液均为50mmol/LPBS，pH6.5，含1mmol/LEDTA；和/或，所述洗脱缓冲液为50mmol/LPBS，pH6.5，含1mmol/LEDTA和0本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种编码rPD蛋白的分离的核酸，其特征在于，所述分离的核酸的核苷酸序列如SEQID No:1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种编码rPD蛋白的分离的核酸，其特征在于，所述分离的核酸的核苷酸序列如SEQIDNo:1所示。


2.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含如权利要求1所述的分离的核酸。


3.如权利要求2所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为pET27b或pET30a；优选地，所述载体为pET30a。


4.一种表达菌株，其特征在于，所述表达菌株包含如权利要求1所述的分离的核酸，或如权利要求2或3所述的表达载体。


5.如权利要求4所述的表达菌株，其特征在于，所述表达菌株的宿主菌为大肠杆菌；优选地，所述菌株为BL21(DE3)。


6.一种rPD蛋白的发酵工艺，其特征在于，培养如权利要求4或5所述的表达菌株，获得发酵液；所述发酵工艺的发酵温度例如为32～37℃，所述发酵液的A600nm值例如为10左右时，添加诱导剂；诱导剂为IPTG，诱导温度例如为16～28℃，诱导时长例如为4h～12h；优选地，所述诱导温度为28℃，所述IPTG的终浓度为0.05～0.5mmol/L。


7.一种rPD蛋白的粗处理方法，其特征在于，所述粗处理方法包含利用精氨酸对如权利要求6所述的发酵工艺获得的发酵液进行高渗处理，以获得rPD蛋白溶液；优选地，所述高渗处理使用精氨酸进行，且随后进行低渗处理；更优选地，所述粗处理方法包括以下步骤：
(1)将所述发酵液进行超滤浓缩，收集菌体浓缩液；
(2)在所述菌体浓缩液中加入精氨酸，室温搅拌例如3h，形成高渗处理液；
(3)将所述高渗处理液按照1:10体积比例与低渗液混合，室温静置例如静置过夜或静置12小时以上，获得混合液；
(4)将所述混合液进行澄清，收集澄清流穿液；
(5)将所述澄清流穿液进行浓缩，收集浓缩截留液；
(6)将所述浓缩截留液使用置换液进行置换，优选置换3～4次，获得浓缩置换液；
进一步更优选地，使用0.45μm、10Kda～30Kda的膜包进行超滤浓缩和/或澄清，和/或，所述高渗处理液中精氨酸的终浓度为0.5mol/L；和/或，所述菌体浓缩液中菌体浓度为0.3g菌体/mL；和/或，所述低渗液为50mmol/LTris-...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴金军，孙莹莹，方红春，赵志强，
申请(专利权)人：江苏坤力生物制药有限责任公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32