一种来源于光伏希瓦氏菌的甜味蛋白及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种来源于光伏希瓦氏菌的甜味蛋白及其制备方法，属于生物技术领域。本发明专利技术筛选获得了来源于光伏希瓦氏菌(Shewanella loihica)的甜味蛋白，该甜味蛋白在大肠杆菌中无需进行结构改造即可高效表达，且具有较高的甜度和较好的稳定性，甜味阈值为200μg/mL，以4mg/mL的蔗糖溶液为标准，该重组蛋白相对蔗糖甜度为其20倍。

【技术实现步骤摘要】
一种来源于光伏希瓦氏菌的甜味蛋白及其制备方法
本专利技术涉及一种来源于光伏希瓦氏菌的甜味蛋白及其制备方法，属于生物

技术介绍
近年来，越来越多的人罹患肥胖、糖尿病、高血脂、龋齿等疾病，由于不能正常代谢糖类，在正常餐食中不得不食用低卡路里的人工甜味剂，如糖精、天冬甜素、环磺酸盐等代糖。然而，这些人工甜味剂会引发精神错乱、膀胱癌、·心血管疾病以及脑瘤等疾病。甜味蛋白是一类具有甜味高、热量低等特性的非糖类甜味剂，可被人体降解为氨基酸，且吸收和利用不依赖于胰岛素，因此，有望成为良好的天然甜味添加剂。目前已知的甜味素蛋白均分离自热带雨林植物，包括Brazzein,Thaumatin,Monellin,Curculin/Neoculin,Mabinlin,Miraculin,Pentadin，其中Thaumatin和Monellin的甜度最高，是等重量蔗糖甜度的3000倍。然而，由于产地和资源限制，植物引种难以成功，以及分离纯化工艺复杂、回收率低、杂质多等原因，天然提取甜味蛋白难以满足食品、药品工业需求。据专利技术人所知，仅Thaumatin可从原生植物的奇异果中提取，已少量应用于制药和化妆品行业；Monellin的提取量无法达到工业生产需求。研究人员尝试使用转基因生物生产大量的甜蛋白，但结果并不理想，尽管获得了具有甜味的转基因土豆、黄瓜、草莓、番茄、玉米等，但这些产品都是作为直接食用的食品，同时由于重组表达产量较低，未能作为原材料进行分离提取制备甜味蛋白。也有研究者尝试在微生物中表达甜味蛋白，尽管重组蛋白均成功表达，但由于宿主微生物细胞的蛋白表达系统与植物的差异，重组蛋白甜味消失，不得不进一步通过定点突变增加甜味蛋白分子表面正电荷数、引入发卡结构改变其三维结构等方案增加其稳定性和甜度。目前未见以基因重组方式实现甜味蛋白大规模生产的报道。
技术实现思路
本专利技术提供了来源于光伏希瓦氏菌的甜味蛋白2GPI及其在作为甜味剂方面的新用途。本专利技术提供了一种编码甜味蛋白2GPI的基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。本专利技术还提供携带所述基因的重组质粒。在一种实施方式中，所述质粒为pET系列质粒。本专利技术还提供了表达甜味蛋白2GPI的重组微生物细胞。在一种实施方式中，所述微生物细胞为大肠杆菌。在一种实施方式中，所述甜味蛋白2GPI的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术还提供了所述甜味蛋白2GPI的制备方法，包括以下步骤：(1)将SEQIDNO.2所示的基因与表达载体pET22b相连接，得到重组表达载体；(2)将所述重组表达载体转化宿主细胞大肠杆菌BL21，得到重组表达细胞；(3)培养所述重组表达细胞，并利用IPTG诱导表达重组蛋白；(4)收集培养液上清中的重组蛋白并利用镍亲和层析柱纯化，即得甜味蛋白2GPI。在一种实施方式中，步骤(1)具体为：以pET22b为表达载体，利用BamHI和HindIII分别对SEQIDNO.2所示的基因和表达载体pET22b进行双酶切，回收酶切片段，以T4DNA连接酶连接，获得重组表达质粒。在一种实施方式中，步骤(2)具体为：以大肠杆菌BL21为表达宿主，利用CaCl2法制备感受态细胞，取1μL所述的重组表达载体，加入50μLBL21感受态细胞中，冰浴30min，42℃热击90s，冰浴2min，涂布含100μg/mL氨苄青霉素的LB平板，37℃过夜培养。在一种实施方式中，步骤(2)所述的重组表达细胞按如下步骤获得：挑取步骤(2)平板上的菌落，经PCR鉴定阳性转化子，分别接种于3mL含氨苄青霉素的液体LB培养基，再转接至20mL培养基，培养至对数中期，加入0.1mMIPTG继续培养3h，诱导重组蛋白表达，培养液8000rpm离心5min，取上清进行SDS-PAGE检测，筛选获得重组蛋白表达量最高的转化子，甘油管保存于-80℃。在一种实施方式中，步骤(3)具体为：将所述重组菌的菌液接种于LB液体培养基，加入氨苄青霉素100μg/mL，37℃180rpm活化培养10～12h至OD600＝0.5～0.7，根据需要将种子液扩大培养，在37℃180rpm培养4～6h到达对数中期(OD600＝0.5～0.7)，加入终浓度为0.1mMIPTG诱导剂，37℃180rpm诱导5h。在一种实施方式中，步骤(4)具体为，离心步骤(3)的培养液，收集上清液，向上清液中加入硫酸铵至饱和度60％，4℃静置过夜使蛋白沉淀，10000rpm离心15min，沉淀中加入少量缓冲液使其全部溶解，得到浓缩的粗酶液，利用Ni-NTA亲和层析柱纯化重组蛋白，利用截留分子量为3500Da的透析袋透析洗脱的蛋白，获得纯化的重组蛋白2GPI。本专利技术还提供所述重组蛋白2GPI在作为甜味剂方面的应用。在一种实施方式中，所述应用是将2GPI蛋白以糖醇、氨基酸、膳食纤维、淀粉、谷物、食用胶等为填充剂，通过共结晶、喷涂、压片、喷雾等方法，获得与同等质量的蔗糖相同甜度的甜味剂。本专利技术还提供所述重组蛋白2GPI作为甜味剂成分用于制备食品添加剂方面的应用。有益效果：本专利技术基于蛋白质三维结构分析，筛选出来源于光伏希瓦氏菌(Shewanellaloihica)的2GPI，具有与Monellin相似的结构，与甜味蛋白受体的结合模型也与Monellin相似，由于均来自于微生物，其天然蛋白不需要进行翻译后修饰，在大肠杆菌中无需进行结构改造即可高效表达，且具有较高的甜度和较好的温度和pH稳定性，甜味阈值为200μg/mL，以4mg/mL的蔗糖溶液为标准，该重组蛋白相对蔗糖甜度为其20倍。附图说明图1为表达2GPI的重组质粒凝胶电泳图；图2为重组菌阳性转化子PCR验证图；图3为重组2GPI蛋白SDS-PAGE凝胶电泳图；图4为蔗糖与重组2GPI蛋白的电子舌响应雷达图；图5为重组2GPI蛋白经不同温度处理2h后的SDS-PAGE凝胶电泳图；图6为重组2GPI蛋白经不同pH缓冲液处理2h后的SDS-PAGE凝胶电泳图。具体实施方式实施例所涉及实验材料如下：限制性内切酶、T4DNA连接酶购于宝生物公司(大连)，氨苄青霉素、IPTG、琼脂粉、NaCl、酵母粉、蛋白胨等常规试剂购于国药生物(南京)，Ni-NTA亲和凝胶及层析柱购于GE公司(瑞典)，pET22b、大肠杆菌BL21购于Invitrogen公司(美国)。实施例12GPI重组表达工程菌的构建合成SEQIDNO.2所示的编码2GPI蛋白的基因，将该基因用BamHI和HindIII进行双酶切并回收，利用同样的限制性内切酶对质粒pET22b进行酶切及回收，以T4DNA连接酶连接，将连接产物pET22b-2GPI转化至大肠杆菌BL21宿主菌，具体为：利用CaCl2法制备感受态细胞，取1μL所述的重组表达载体，加入50μLBL21感受态细胞中，冰浴30min，42℃热击9本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种编码甜味蛋白2GPI的基因，其特征在于，含有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种编码甜味蛋白2GPI的基因，其特征在于，含有如SEQIDNO.2所示的核苷酸序列。


2.携带权利要求1所述基因的重组质粒。


3.表达甜味蛋白的重组微生物细胞，其特征在于，所述甜味蛋白含有SEQIDNO.1所示的氨基酸序列。


4.根据权利要求3所述的重组微生物细胞，其特征在于，以大肠杆菌为宿主。


5.根据权利要求4所述的重组微生物细胞，其特征在于，以pET22b为表达载体，表达SEQIDNO.2所示的甜味蛋白基因。


6.一种生产甜味蛋白的方法，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：李晓敏，陆健，申丹丹，兰佳鑫，蔡国林，吴殿辉，
申请(专利权)人：江南大学，江南大学如皋食品生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：江苏;32