香蕉枯萎病菌FoNpp1基因在调控香蕉枯萎病菌致病力中的应用制造技术

本发明专利技术公开了香蕉枯萎病菌FoNpp1基因在调控香蕉枯萎病菌致病力中的应用。本发明专利技术通过构建基因敲除载体，将FoNpp1基因导入香蕉枯萎病菌原生质体；利用同源重组方法将该基因从香蕉枯萎病菌中敲除，获得敲除突变体；通过构建基因回补载体，利用随机插入的方法将该基因回补到敲除突变体中，获得回补突变体。敲除突变体在生长发育方面不存在缺陷，对高渗胁迫、氧化胁迫等不敏感。致病性测定结果表明，与香蕉枯萎病菌野生型相比，敲除突变体镰刀菌酸含量及对巴西蕉的致病力显著降低。表明FoNpp1基因是香蕉枯萎病菌的致病相关基因，FoNpp1是香蕉枯萎病菌致病性所必需的，在防控香蕉枯萎病中具有较大的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
香蕉枯萎病菌FoNpp1基因在调控香蕉枯萎病菌致病力中的应用
本专利技术涉及植物基因工程
，更具体地，涉及香蕉枯萎病菌FoNpp1基因在调控香蕉枯萎病菌致病力中的应用。
技术介绍
香蕉枯萎病(Fusariumwilt)是由尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusariumoxysporumf.sp.cubense，Foc)引起的一种土传维管束坏死的系统性病害，是目前制约我国香蕉生产的最重要因素。根据Foc对不同香蕉品系或者属种的致病性差异，将其划分为3个生理小种；危害我国植蕉区的主要有1号生理小种(Foc1)和4号生理小种(Foc4)。其中，Foc4对我国香蕉的危害最大，几乎能侵染所有品种的香蕉。研究表明，香蕉枯萎病菌成功侵染香蕉依赖于一系列致病因子，主要包括各种酶类、毒素、生长调节物质、分泌蛋白等。例如：中国专利CN110656116A公开了基因FoCWM在调控香蕉枯萎病菌致病力中的应用，中国专利CN110669773A公开了基因FoPDCD5在调控香蕉枯萎病菌致病力中的应用，中国专利CN111560384A公开了基因FoRnt在调控香蕉枯萎病菌致病力中的应用，中国专利CN110656116A公开了基因FoCWM在调控香蕉枯萎病菌致病力中的应用。充分挖掘Foc致病相关基因并开展其功能研究，对于香蕉枯萎病的防控具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供香蕉枯萎病菌FoNpp1基因在调控香蕉枯萎病菌致病力中的应用。本专利技术的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：本专利技术公开了香蕉枯萎病菌基因FoNpp1及其编码蛋白FoNpp1的新功能。所述香蕉枯萎病菌基因FoNpp1的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，其编码的蛋白FoNpp1的序列如SEQIDNO：2所示。专利技术人团队前期在香蕉枯萎病菌分泌蛋白质组学研究中，鉴定到一个未知蛋白(Uncharacterizedprotein，命名为FoNpp1)；经SignalP、TargetP、WoLFPSORT、GPIModificationSitePredication和TMHMM软件预测分析，该蛋白含有N-端信号肽，定位在细胞外，无GPI锚定位点和跨膜结构域，属于经典的分泌蛋白，但是未明确该蛋白在香蕉枯萎病菌中的生物学功能。本专利技术通过构建基因敲除载体，将其导入香蕉枯萎病菌原生质体；利用同源重组方法将该基因从香蕉枯萎病菌中敲除，获得敲除突变体ΔFoNpp1；通过构建基因回补载体，将其导入ΔFoNpp1原生质体；利用随机插入的方法将该基因回补到敲除突变体中，获得回补突变体ΔFoNpp1-com。该突变体在生长发育方面不存在缺陷，对高渗胁迫、氧化胁迫等不敏感。致病性测定结果表明，与香蕉枯萎病菌野生型相比，敲除突变体ΔFoNpp1镰刀菌酸含量及对巴西蕉的致病力显著降低。以上试验证明，FoNpp1基因是香蕉枯萎病菌的致病相关基因，FoNpp1是香蕉枯萎病菌致病性所必需的。基于此，本申请首先请求保护关于FoNpp1基因或FoNpp1蛋白的如下用途：SEQIDNO：1所示FoNpp1基因或SEQIDNO：2所示FoNpp1蛋白在调控香蕉枯萎病菌的致病力和/或镰刀菌酸的含量中的应用。进一步地，为在降低香蕉枯萎病菌致病力和/或镰刀菌酸含量中的应用。进一步地，为在降低香蕉枯萎病菌对香蕉的致病力中的应用。优选地，所述香蕉枯萎病菌为香蕉枯萎病菌4号生理小种(Foc4)。由于FoNpp1基因是香蕉枯萎病菌致病性所必需的，因而可将FoNpp1基因作为靶标基因，研制防治香蕉枯萎病菌的杀菌剂。因此本专利技术还提供SEQIDNO：1所示FoNpp1基因或SEQIDNO：2所示FoNpp1蛋白作为防治靶标在制备防治香蕉枯萎病菌的杀菌剂中的应用。本专利技术还提供一种防治香蕉枯萎病的杀菌剂，含有阻断或抑制香蕉枯萎病菌FoNpp1基因表达的制剂。优选地，所述制剂为与香蕉枯萎病菌FoNpp1基因的靶RNA具有互补序列的反义RNA。进一步优选地，所述反义RNA为siRNA或shRNA。本专利技术还提供一种防治香蕉枯萎病的方法，通过该阻断或抑制香蕉枯萎病菌FoNpp1基因的表达。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术公开了香蕉枯萎病菌4号小种一个未知蛋白基因FoNpp1及其编码蛋白FoNpp1的新功能。所述基因FoNpp1的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，其编码的蛋白FoNpp1的序列如SEQIDNO：2所示。本专利技术将FoNpp1基因从香蕉枯萎病菌中敲除，所得到的香蕉枯萎病菌FoNpp1基因敲除突变体在孢子形态、菌丝形态、抗高渗透、氧化胁迫等方面与野生型相比没有显著性差异；但FoNpp1的缺失导致了其镰刀菌酸的含量及致病力的显著降低；表明FoNpp1基因是香蕉枯萎病菌的致病相关基因，FoNpp1是香蕉枯萎病菌致病性所必需的，在防控香蕉枯萎病中具有较大的应用前景。附图说明图1为香蕉枯萎病菌基因FoNpp1敲除载体的构建示意图。图2为香蕉枯萎病菌基因FoNpp1回补载体示意图。图3为部分潮霉素抗性转化子目的基因FoNpp1的PCR扩增。M：DNAMarker；泳道WT：香蕉枯萎病野生型；泳道1-6：转化子1-6。图4为部分潮霉素抗性转化子hph基因的PCR扩增。M：DNAMarker；泳道WT：香蕉枯萎病野生型；泳道1-6：转化子1-6。图5为部分博来霉素抗性转化子FoNpp1的PCR扩增。M：DNAMarker；泳道WT：香蕉枯萎病菌野生型；泳道1-4：回补转化子。图6为敲除突变体△FoNpp1抗高渗透压能力分析。图7为敲除突变体△FoNpp1氧化胁迫分析。图8为香蕉枯萎病菌敲除突变体△FoNpp1的致病性分析。具体实施方式以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本专利技术，但实施例并不对本专利技术做任何形式的限定。除非特别说明，本专利技术采用的试剂、方法和设备为本
常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。实施例11、实验材料1.1供试菌株及植物香蕉枯萎病菌4号生理小种(Foc4)，供试香蕉品种为巴西蕉Cavendish(AAA)。1.2宿主菌及质粒载体宿主菌为大肠杆菌DH5α，克隆载体为pMD18-T，基因敲除载体为双元载体pCT74，基因回补载体为pCTZN(由本实验室在pCT74质粒基础上改造得来，即将pCT74上的SGFP和hph基因替换成博来霉素Zeocin基因)，该质粒也在专利“201910986131.4、基因FoPDCD5在调控香蕉枯萎病菌致病力中的应用”中公开。2、实验方法2.1FoNpp1基因上下游同源片段的扩增申请人前期在香蕉枯萎病菌分泌蛋白质组学研究中，鉴定到一个未知蛋白(Uncharacterizedprotein，命名为FoNpp1)，其编码基因FoNpp1的序列如S本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.SEQ ID NO：1所示FoNpp1基因或SEQ ID NO：2所示FoNpp1蛋白在调控香蕉枯萎病菌的致病力和/或镰刀菌酸的含量中的应用。/n

【技术特征摘要】
1.SEQIDNO：1所示FoNpp1基因或SEQIDNO：2所示FoNpp1蛋白在调控香蕉枯萎病菌的致病力和/或镰刀菌酸的含量中的应用。


2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，为在降低香蕉枯萎病菌致病力和/或镰刀菌酸含量中的应用。


3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，为在降低香蕉枯萎病菌对香蕉的致病力中的应用。


4.根据权利要求1～3任一所述应用，其特征在于，所述香蕉枯萎病菌为香蕉枯萎病菌4号生理小种。


5.SEQIDNO：1所示FoNpp1基因或SEQIDNO...

【专利技术属性】
技术研发人员：李云锋，何艳秋，聂燕芳，李华平，王振中，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东;44