一种猪胸膜放线杆菌基因、蛋白的原核表达和应用制造技术

本发明专利技术属于生物医药技术领域，公开了一种猪胸膜放线杆菌基因、蛋白的原核表达和应用，以App7型菌株基因组为模板扩增出AdhE的全基因序列；成功构建pET‑32a(+)‑rAdhE原核表达载体，实现其在大肠杆菌BL21中的可溶性诱导表达，融合蛋白大小为110kDa。本发明专利技术通过ELISA检测证明原核表达的rAdhE融合蛋白能刺激小鼠产生高水平特异性抗体，具有较好的免疫原性；rAdhE免疫小鼠后能够抵御APP7型的致死性攻毒和70％的APP1型的攻读保护，减轻小鼠体内急性炎症反应。

【技术实现步骤摘要】
一种猪胸膜放线杆菌基因、蛋白的原核表达和应用
本专利技术属于生物医药
，尤其涉及一种猪胸膜放线杆菌基因、蛋白的原核表达和应用。
技术介绍
目前，胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacilluspleuropneumoniae，App)是引起猪胸膜肺炎的病原体，猪胸膜肺炎是一种具有高度传染性的严重猪疾病，可与呼吸道病原体如伪狂犬病病毒和/或猪肺炎支原体的混合感染使病情恶化。对全球各地的养殖业均造成重大损失。猪胸膜肺炎的特点是出血性、纤维性和坏死性肺囊肿，临床表现从急性到慢性不等。接触这种微生物可能导致慢性感染，导致动物无法茁壮成长，即使猪能存活下来，它们也会成为无症状的携带者，将疾病传染给健康的猪群。乙醛/乙醇脱氢酶(aldehyde/alcoholdehydrogenase,AdhE)是一种由AdhE基因编码的双功能脱氢酶，具有乙醛脱氢酶和乙醇脱氢酶的催化活性。在之前的关于AdhE研究中，大多数都集中于其在乙醇代谢以及硝化应激和乙醇耐受性上发挥的功能，尚未有传染性胸膜肺炎放线杆菌(7型)AdhE蛋白在亚单位疫苗中的应用。其广泛地分布在真核生物和原核生物中，真核生物中有13个，原核生物中有93个。这种广泛存在说明它对生命的过程有重要意义AdhE是一种双功能酶，具有乙醛脱氢酶和乙醇脱氢酶的催化活性。近年来，大量研究结果表明AdhE可以诱导宿主的天然免疫。综上所述，现有技术存在的问题是：现有关于AdhE的研究大多数都集中于其在乙醇代谢以及硝化应激和乙醇耐受性上发挥的功能，尚未有传染性胸膜肺炎放线杆菌(7型)AdhE蛋白在亚单位疫苗中的应用。解决上述技术问题的难度：本专利技术首次对猪胸膜放线杆菌7型AdhE基因进行扩增和蛋白原核表达，并通过免疫原性研究验证其具有很好的同源免疫原性，AdhE基因全长2616bp，蛋白大小95kD，蛋白偏大，表达难度也随之增加，本专利技术中通过优化诱导条件，最终克服困难，成功高产的表达了APP7型的AdhE蛋白。解决上述技术问题的意义：猪胸膜放线杆菌严重危害养猪业发展，特别是目前非洲猪瘟疫情国内流行，APP感染损伤猪群呼吸系统，从而可能加重非洲猪瘟疫情传播。高产的APP7型AdhE蛋白体系的建立能够为APP亚单位疫苗研制提供技术保障，为APP防控提供技术支撑。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种一种猪胸膜放线杆菌基因、蛋白的原核表达和应用，具体涉及一种猪胸膜放线杆菌7型AdhE蛋白的原核表达和应用。本专利技术为传染性胸膜肺炎放线杆菌(7型)AdhE蛋白的亚单位疫苗提供候选，为传染性胸膜肺炎疫病防控奠定基础。本专利技术是这样实现的，一种传染性胸膜肺炎放线杆菌AdhE基因，所述传染性胸膜肺炎放线杆菌AdhE基因的DNA序列为SEQIDNO：1。本专利技术的另一目的在于提供一种利用所述传染性胸膜肺炎放线杆菌AdhE基因构建的表达载体，购买于北京全式金生物技术有限公司；并在大肠杆菌BL21中的可溶性诱导表达。本专利技术的另一目的在于提供一种所述表达载体的构建方法，所述表达载体的构建方法包括：(1)AdhE全基因的扩增：以传染性胸膜肺炎放线杆菌7型的基因组DNA为模板，根据所设计的特异性引物为PCR引物，经PCR扩增出大小约在2631bp的目的片段。(2)AdhE蛋白原核表达载体的构建及测序鉴定：将回收后的AdhE基因目的片段和质粒pET-32a(+)进行BamHⅠ+NotⅠ双酶酶切后，AdhE目的片段再与原核表达载体pET-32a(+)连接得到重组原核表达质粒rpET-32a(+)-Adh，原核表达重组质粒进行酶切鉴定，单双酶切鉴定结果显示：单酶酶切出一条线性条带，大小大约在8500bp左右；双酶酶切出两条线性条带，一条大小大约在2600bp左右，与目的片段大小相吻合，另一条大小大约在5900bp左右，与pET-32a(+)载体大小相吻合。测序结果显示，目的片段与App7型AdhE基因序列一致，片段大小为2616bp。ADhE基因序列：atggctaacaatgcaaaaaatgcacaaccatatgatgctcaaaccgaagtaaatcagctagttgaaaacggtttaaaagctctcgaagaatttcgtcagcttaaccaagaacaagtggattacatcgttgcaaaagcctccgtggcggcactggataaacatggcgttctagcaatgcacgcttatgaagaaacggggcggggcgtatttgaagacaaagcgactaaaaatctatttgcttgtgaatatgtcgtaaataatatgcgacatttaaaaacggcggggataattagtgaagataacgtaaccggtattaccgaaatcgccgaccctgtcggtgtcgtatgcggcataactccgacaaccaacccaacctcaaccactatcttcaaagcgttaatcgccctcaaaactcgtaacccaatcgtttttgctttccacccttccgcacaacaatcttccgctcatgccgctcaagttgtatatgatgccgccgttgctgccggcgcaccgaaaaattgtgtgcaatggattaaaaccccgtcaatggaaggtacttccgcattaatgaaacatccgggtattgcaaccattcttgctaccggcggtaatgccatggttgaagcggcatattcttgcggtaaaccggcattaggcgtaggggcgggtaacgtaccggcttatgtggaaaaaactgctaaactagaacaagctgtttacgacattgtgatgtcaaaatcttttgacaacggtatgatttgtgcatccgaacaagcggcgattgtcgataaagaaatctatgccgatttcgtgaaagaaatgcaatcttacggcgtatatctggtaaataaaaaagaaaaagtactgttagaaaaattcattttcggtgtggataaagccaaagatgaaaactgtgccggagcaaaattaaatgcggcggtcgtaggtaaaccggcggcatggattgccgaacaagcgggttttagcgtgccaccaaaaacaaacatcctacttgcagaatgtgcgtttgtcggtgaaggcgaaccgcttactcgtgagaaattatcaccggtacttgcattattaaaatcgaattcaaccgaacacggtttagaactttccgaagcgatggtaaatttctacggtttaggtcactcggcggcaatccatacgcaaaatgtcgaattagcaaaaacattcggcgagcgcgttaaagcgattcgtgtaatttggaactcgccatcaacattcggtggtatcggtga本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种传染性胸膜肺炎放线杆菌AdhE基因，其特征在于，所述传染性胸膜肺炎放线杆菌AdhE基因的DNA序列为SEQ ID NO：1。/n

【技术特征摘要】
1.一种传染性胸膜肺炎放线杆菌AdhE基因，其特征在于，所述传染性胸膜肺炎放线杆菌AdhE基因的DNA序列为SEQIDNO：1。


2.一种利用权利要求1所述传染性胸膜肺炎放线杆菌AdhE基因构建的表达载体，其特征在于，所述表达载体在大肠杆菌BL21中的可溶性诱导表达。


3.一种如权利要求2所述表达载体的构建方法，其特征在于，所述表达载体的构建方法包括：
(1)AdhE全基因的扩增：以传染性胸膜肺炎放线杆菌7型的基因组DNA为模板，根据所设计的特异性引物为PCR引物，经PCR扩增出大小在2631bp的目的片段；
(2)AdhE蛋白原核表达载体的构建及测序鉴定：将回收后的AdhE基因目的片段和质粒pET-32a(+)进行BamHⅠ+NotⅠ双酶酶切后，AdhE目的片段再与原核表达载体pET-32a(+)连接得到重组原核表达质粒rpET-32a(+)-Adh，原核表达重组质粒进行酶切鉴定。


4.一种利用权利要求1所述传染性胸膜肺炎放线杆菌AdhE基因编码的蛋白，其特征在于，所述蛋白氨基酸序列为SEQIDNO：2。


5.一种如权利要求4所述的蛋白的原核表达方法，其特征在于，所述AdhE蛋白的原核表达方法包括以下步骤：
步骤一，根据App7型全基因序列，设计AdhE蛋白基因的上下游引物分别为AdhEP1、AdhEP2；
步骤二，AdhE基因扩增与原核表达载体pET-32a(+)连接；
步骤三，AdhE蛋白的原核表达及纯化与WB鉴定。


6.如权利要求5所述传染性胸膜肺炎放线杆菌AdhE蛋白的原核表达方法，其特征在于，步骤一中，所述上游引物的基因序列为：AdhEP1：CGCGGATCCATGGCTAACAATGCAAAA(BamHI)；
所述下游引物的基因序列为：Adh...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐志文，朱玲，蔡瑶，赵军，谷思睿，张儒博，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：四川;51