一种拓展性多能干细胞诱导分化为心肌细胞的方法及应用技术

本发明专利技术提供一种拓展性多能干细胞诱导分化为心肌细胞的方法及应用，属于生物医学技术领域。本发明专利技术诱导分化所用试剂为化学成分明确的培养基，可获得纯度高、批次间分化效率稳定的心肌细胞。与现有多能干细胞分化的心肌细胞相比，本发明专利技术获得的心肌细胞早期增殖能力强，延长培养并构建成心肌微组织后成熟度高，排列结构更整齐，功能性收缩力增强，因此适用于心脏疾病机理研究、药物筛选和细胞治疗等多种应用，因此具有良好的实际应用之价值。

【技术实现步骤摘要】
一种拓展性多能干细胞诱导分化为心肌细胞的方法及应用
本专利技术属于生物医学
，具体涉及一种拓展性多能干细胞诱导分化为心肌细胞的方法及应用。
技术介绍
公开该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。心脏疾病是全球发病率和死亡率最高的疾病。冠心病、高血压等会导致心肌细胞死亡，心肌出现重构并逐步恶化，最终出现心肌收缩舒张功能障碍，即心力衰竭。心衰病人无法被药物治愈，只能等待供体非常紧缺的心脏移植。近年来随着冠脉搭桥、心脏支架介入治疗等手段开展，以及药物及时干预会延长心梗和心脏慢性病患者生存时间，但心衰发生率却呈逐年上升趋势。心肌细胞自身增殖能力非常低，并且分离成体心肌细胞体外培养困难，给药物筛选和机制研究都造成阻碍。再生医学是心脏疾病研究领域一个非常有潜力的方向，干细胞是其中最重要的工具，利用多能干细胞分化成为心肌细胞，对于心肌细胞药物筛选、细胞治疗以及疾病模型的研究都有重要意义。人诱导性多能干细胞(humaninducedpluripotentstemcells，hiPSCs)是公认有再生医学转化潜力的种子细胞，通过体细胞重编程产生，具有向胚内多种细胞类型分化的能力，并且可以有效避开使用胚胎干细胞(embryonicstemcells，ESC)分化存在的伦理争端和免疫排斥风险。通过调节Wnt信号可以诱导iPSCs分化为心肌细胞(DirectedcardiomyocytedifferentiationfromhumanpluripotentstemcellsbymodulatingWnt/b-cateninsignalingunderfullydefinedconditions)，但是不同iPSCs定向分化效率和分化批次不稳定及成熟度不够等问题是制约其应用的重要因素。2017年，Yang等首次建立了具有全能性特征的拓展多能干细胞系(ExtendedPluripotentStemCells，EPSC)，此细胞系的多能性高于iPSCs，同时具有胚内和胚外组织发育潜能，表现出优秀的异种嵌合能力，并且具备单细胞传代和高增殖率扩增的优势(YangYang等.Cell.20176；169(2):243-257)。但此时EPS由ESC转化而来，并且培养时需要滋养层细胞，相对制约其转化应用。2020年Ran等使用小分子化合物诱导条件代替饲养层细胞成功将人ESCs和iPSCs转化为EPSCs，建立了成分明确、简单快速的EPS构建体系，进一步为EPS的转化应用奠定良好基础(RanZheng等.bioRxiv.18Oct2020)。理论上EPS应该会比iPSCs具有更高的潜能性，但EPS是否可以作为心肌细胞的种子细胞，能否采用成分明确的诱导条件稳定形成高效率分化的心肌细胞，应用于心脏药物开发和心肌再生研究领域是未知的，需要进一步探索。
技术实现思路
针对上述现有技术的不足，专利技术人经长期的技术与实践探索，提供一种拓展性多能干细胞诱导分化为心肌细胞的方法及应用。本专利技术通过小分子分阶段调控WNT信号通路，从而诱导EPS细胞分化为心肌细胞，因此具有良好的实际应用之价值。具体的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术的第一个方面，提供拓展的多潜能干细胞(EPSC)在制备心肌细胞中的应用。具体的，所述应用包括：将上述拓展的多潜能干细胞诱导分化为心肌细胞。更具体的，所述诱导分化方法包括：通过小分子分阶段调控WNT信号通路，诱导EPS细胞分化为心肌细胞。本专利技术的第二个方面，提供一种拓展性多能干细胞诱导分化为心肌细胞的方法，所述方法包括：通过小分子分阶段调控WNT信号通路，诱导EPS细胞分化为心肌细胞。具体的，所述方法包括：采用化学成分明确的培养基条件进行诱导分化，优选的，所述化学成分明确的培养基条件为使用成分明确的血清替代物和生长因子替代血清。优选的，在小分子分阶段调控前，所述方法还包括将EPSC经mTeSRTM1和/或KnockOutTMDMEM/F-12+B27+FGF2+TGFβ快速过渡转化；进一步优选的，B27细胞培养添加剂中含有胰岛素；培养时间控制为1-4天；进一步优选的，当拓展性多能干细胞汇合度达到50％以上时即可起始诱导分化形成心肌细胞，优选大于85％，更优选为95％以上。优选的，所述小分子分阶段调控，具体包括：先添加化学小分子CHIR99021，进行培养；再添加WNT信号通路抑制化学小分子IWR和IWP2，进行培养。其中，所述CHIR99021的使用浓度控制为5-10μM，优选为7.5μM；使用IWR的浓度范围为2.5-7.5μM，优选为5μM；使用IWP2的浓度范围1-5μM，优选为2.5μM。通过控制加入的化学小分子浓度和时间，从而获得高效分化的心肌细胞。在小分子分阶段调控时期，使用的细胞培养基包括1640+B27，优选的B27细胞培养添加剂中不含有胰岛素。优选的，小分子分阶段调控时期培养时间控制为3-7天，优选为4-5天。本专利技术的第三个方面，提供上述培养方法获得的心肌细胞。所述心肌细胞为EPSC源心肌细胞，采用上述培养方法获得的心肌细胞，其数量多，且早期繁殖能力强。本专利技术的第四个方面，提供上述培养方法和/或上述心肌细胞在如下任意一种或多种中的应用：a)制备心肌细胞产品用于相关基础研究；b)药物筛选及心脏相关疾病诊断；c)心脏相关疾病治疗。其中，所述应用a)中，所述相关基础研究包括对心肌细胞结构功能、特性、信号通路以及电生理检测及研究；所述应用b)中，包括药物安全评价和新药分子研发；所述应用c)中，所述心脏相关疾病包括心梗；所述治疗方法包括细胞治疗。上述一个或多个技术方案的有益技术效果：1、上述技术方案通过对EPSC分化不同天数过程中心肌细胞标志物cTNT的检测，首次将EPSC成功分化为高纯度的心肌细胞。2、上述技术方案通过对EPSC分化的心肌与hiPSC分化的心肌细胞对比，EPSC分化心肌表现为相同底面积下，分化所得心肌细胞数量更多，一般计数大于10Million/9.6cm2。重铺细胞后，EPSC分化心肌早期增殖能力相对较高。3、随着培养时间延长及构建成心肌微组织后，EPSC分化心肌组织表现更加成熟，排列结构整齐，细胞连接有分布到两端，功能性收缩力增大。综上，上述技术方案将为干细胞作为产生心肌细胞的种子细胞提供更多选择，促进干细胞向心肌细胞分化在心脏疾病相关领域的应用，在心脏疾病诊断、药物筛选和细胞治疗方面具有广泛的前景，因此具有良好的实际应用之价值。附图说明构成本专利技术的一部分的说明书附图用来提供对本专利技术的进一步理解，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。图1是本专利技术分化流程方案及培养不同天数时细胞光镜图。图2是本专利技术实施例3中分化不同阶段流式结果和不本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.拓展的多潜能干细胞在制备心肌细胞中的应用。/n

【技术特征摘要】
1.拓展的多潜能干细胞在制备心肌细胞中的应用。


2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用包括：将拓展的多潜能干细胞诱导分化为心肌细胞。


3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述诱导分化方法包括：通过小分子分阶段调控WNT信号通路，诱导EPS细胞分化为心肌细胞。


4.一种拓展性多能干细胞诱导分化为心肌细胞的方法，其特征在于，所述方法包括：通过小分子分阶段调控WNT信号通路，诱导EPS细胞分化为心肌细胞。


5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法包括：通过小分子分阶段调控WNT信号通路，诱导EPS细胞分化为心肌细胞，在小分子分阶段调控前，所述方法还包括将EPSC经mTeSRTM1和/或KnockOutTMDMEM/F-12+B27+FGF2+TGFβ快速过渡转化；
优选的，B27细胞培养添加剂中含有胰岛素；培养时间控制为1-4天；
进一步优选的，当拓展性多能干细胞汇合度达到50％以上时即可起始诱导分化形成心肌细胞，优选大于85％，更优选为95％以上。


6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述小分子分阶段调控，具体包括：先添加化学小分子CHIR990...

【专利技术属性】
技术研发人员：张冬卉，李俐，蔡琳，万忠均，汪如香，
申请(专利权)人：湖北大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42