一种成年小鼠心房肌细胞的分离与培养方法技术

本发明专利技术公开了一种成年小鼠心房肌细胞的分离与培养方法，本方法在心房肌细胞的不同培养阶段分别利用两种不同培养液进行培养，以增加心房肌细胞的数量与质量，在培养过程中加大了对细胞的营养与保护，大大降低了心房肌细胞的受损率。铺板培养液的应用能够使离体的心房肌细胞快速适应培养环境，提高细胞贴壁的效率；普通培养液则为心房肌细胞的后续培养提供具有稳定温度、pH及充足营养的生存条件，保持其良好的生长状态。结果表明，本发明专利技术方法能够得到高产量与高质量的成年小鼠心房肌细胞，成本低且高效稳定，分离出的心房肌细胞数量大、活力高，能在体外继续培养4‑5天，为在细胞水平上研究成年小鼠心脏生理及病理功能提供了良好的实验素材。

【技术实现步骤摘要】
一种成年小鼠心房肌细胞的分离与培养方法
本专利技术属于细胞分离与培养
，具体涉及一种成年小鼠心房肌细胞的分离与培养方法。
技术介绍
心房颤动(简称房颤)是一种以快速、无序的心房电活动为特征的室上性心律失常，是临床上最常见的心律失常，构成中老年人健康生活的重大威胁之一，有关房颤的发现与研究已经进行了100多年，但其发生机制却仍未完全清楚。心房肌细胞模型能够排除在体激素水平等多种因素干扰，是目前研究房颤必不可少的体外实验模型，能够在毒性实验、基因工程、病理模型、临床药物筛选等方面广泛应用。因此，为达到在细胞及分子水平研究房颤发生发展机制的目标，首先必须获得高产量及高质量的心房肌细胞。目前成熟稳定且使用频繁的是针对成年大鼠心室肌细胞的分离与培养技术，最常见的是利用灌流装置Langendorf进行主动脉逆行恒压灌流的方法来分离。利用该方法得到的大鼠心室肌细胞状态稳定，效果良好，并能在体外持续性培养2-3天。而哺乳动物心脏的心房壁比心室壁要薄，心房腔体积要小于心室腔，心房体积相对较小。受此生理结构的限制，大鼠的心房肌细胞在上述分离技术中不易获得且极易受损，得到的细胞产量及质量均无法满足体外继续培养的条件。因此，有关心房肌细胞的分离培养技术目前仍停留在急性分离阶段，这在一定程度上制约了对心房及房颤等相关疾病的研究。小鼠(mouse)是目前研究中最常用的实验动物品种，其以繁殖能力强、易饲养、实用经济、基因型稳定、易于筛选等特点，常被用于建立多种转基因动物模型。但与大鼠相比，成年小鼠因心脏体积更小、个体差异较大、消化终点不好判断、细胞数目有限、血管管径小、主动脉血管壁薄、主动脉插管困难等原因，使对其心房肌细胞的分离与培养技术更加难以进行，无法开展进一步的研究，阻碍了其在生命科学中的应用。心房肌细胞属于终末分化的细胞，一旦成熟便失去了分裂与增殖能力，所以很难将胎鼠或乳鼠心肌细胞培养的一些理论应用到成年鼠中。目前研究所用的成年小鼠心房肌细胞大多是通过急性方法获得，直接将心房由心脏剪下，在含高钾的酶溶液中消化分离，得到的心房肌细胞数量与质量十分有限，且无法继续培养，并不适用于长期研究。之前许多研究者在培养液中使用浓度为10mM的BDM以维持成年小鼠心肌细胞的状态，但得到的心肌细胞成活率在培养24h之后便急剧下降，细胞的贴附力降低，造成常规更换培养基和冲洗过程中细胞的大量丢失，大幅度降低了细胞产量。而研究人员最近将BDM替换成一种特异性更强的细胞运动抑制剂(-)-Blebbistatin，能够更大程度地提高心房肌细胞成活率。但由于高浓度(-)-Blebbistatin(25μM)对心肌细胞的收缩抑制效应大，换液时极难冲洗干净，限制了随后的细胞功能研究。除此之外，(-)-Blebbistatin造价十分昂贵，提高了分离培养技术的成本，经济性和实用性十分有限。
技术实现思路
为了克服上述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供一种用于分离成年小鼠心房肌细胞、获得高产量与高质量的心房肌细胞并能够继续培养的技术方法。为了达到上述目的，本专利技术采用以下技术方案予以实现：本专利技术公开的一种成年小鼠心房肌细胞的分离与培养方法，包括以下步骤：1)将新鲜的离体小鼠心脏清洗后移除多余组织，然后转移至灌流系统灌注灌流缓冲液，然后灌注消化液直至心脏肿胀、颜色呈白色且表面松软，再延长灌流2～4min；2)将左、右心房分别剪开，置于细胞收集液中消化处理，然后将心房剪碎、吹打，直至分离成单细胞，即无组织团块且分散均匀；3)将步骤2)处理后的心房细胞离心、弃上清后用细胞保存液吹散重悬细胞，静置待活细胞自由沉降后，吸去上清，加入铺板培养基，吹打重悬细胞；4)对步骤3)处理得到的细胞进行梯度复钙处理，然后在终浓度为1.0mM的钙离子的铺板培养基中存储，得到细胞混合液；5)移除灌注系统，将得到的细胞混合液铺于玻璃片上，在37℃下孵育1～2h，添加铺板培养基培养1h后，更换至普通培养基中常规培养，每24h换液一次，完成培养。优选地，步骤1)中，是以4mL/min的速度持续灌注4～7min的灌流缓冲液。优选地，步骤2)中所述消化处理是在细胞收集液中于37℃水浴加热，持续消化15min。优选地，步骤3)中，离心处理是以400-500rpm的条件处理5min。优选地，所述的铺板培养基，每5mL中包含：4.2mL的MEM，0.5mL的CalfSerumorFBS，2.5μL的50mM的(-)-Blebbistatin，0.05mL的10000U/mlPenicillin-G，0.05mL的L-Glutamine，0.1mL的500mM的BDM；0.05mL的10％Na-ATP，0.05mL的1MHEPES，25μL的0.1MEGTA。优选地，所述的普通培养基，每10mL中包含：9.3mL的MEM，0.1mL的10％Endotoxin-and-lipid-freeBSA，0.2mL的500mMBDM，5μl的50mM(-)-Blebbistatin，0.1mL的10000U/mlPenicillin,0.1mL的L-Glutamine，0.1mL的ITS，0.1mL的1MHEPES，50μL的0.1MEGTA。优选地，所述细胞收集液中含有牛血清白蛋白、Ⅱ型胶原酶、蛋白酶XIV、弹性蛋白酶及CaCl2。优选地，所述梯度复钙处理操作如下：向重悬的细胞中加入CaCl2储液，混匀使溶液钙离子浓度依次达到0.1mM、0.2mM、0.5mM和1.0mM，且每个浓度至少等待3分钟以上以待细胞适应，再加到下一个浓度。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术公开了一种针对成年小鼠心房肌细胞的分离与培养方法，使其更加针对于心房肌细胞的分离条件，提高心房肌细胞的获得率和纯度。分离得到的心房肌细胞在含有消化酶的细胞收集液中继续消化15min，待预适应后再吹散，显著减少了对体外细胞的刺激与损伤。此外，本方法在心房肌细胞的不同培养阶段分别利用两种不同培养液进行培养，以增加心房肌细胞的数量与质量，在培养过程中加大了对细胞的营养与保护，大大降低了心房肌细胞的受损率。铺板培养液的应用能够使离体的心房肌细胞快速适应培养环境，提高细胞贴壁的效率；培养培养液则为心房肌细胞的后续培养提供具有稳定温度、pH及充足营养的生存条件，保持其良好的生长状态。同时，本方法指出使用BDM(10mM)和(-)-Blebbistatin(5μM)结合培养，能够显著提高成年小鼠心房肌细胞原代培养的细胞产量，维系培养过程中良好的细胞形态，延长培养时间，在收获高质量心房肌细胞的同时大大降低了造价成本。结果表明，本专利技术方法能够得到高产量与高质量的成年小鼠心房肌细胞，成本低且高效稳定，分离出的心房肌细胞数量大、活力高，能在体外继续培养4-5天，，为心血管药理病理及转导基因的实验研究提供了良好的时间窗口，为在细胞水平上研究成年小鼠心脏生理及病理功能提供了良好的实验素材。进一步地，本专利技术的方法根据心房本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种成年小鼠心房肌细胞的分离与培养方法，其特征在于，包括以下步骤：/n1)将新鲜的离体小鼠心脏清洗后移除多余组织，然后转移至灌流系统灌注灌流缓冲液，然后灌注消化液直至心脏肿胀、颜色呈白色且表面松软，再延长灌流2～4min；/n2)将左、右心房分别剪开，置于细胞收集液中消化处理，然后将心房剪碎、吹打，直至分离成单细胞，即无组织团块且分散均匀；/n3)将步骤2)处理后的心房细胞离心、弃上清后用细胞保存液吹散重悬细胞，静置待活细胞自由沉降后，吸去上清，加入铺板培养基，吹打重悬细胞；/n4)对步骤3)处理得到的细胞进行梯度复钙处理，然后在终浓度为1.0mM的钙离子的铺板培养基中存储，得到细胞混合液；/n5)移除灌注系统，将得到的细胞混合液铺于玻璃片上，在37℃下孵育1～2h，添加铺板培养基培养1h后，更换至普通培养基中常规培养，每24h换液一次，完成培养。/n

【技术特征摘要】
1.一种成年小鼠心房肌细胞的分离与培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将新鲜的离体小鼠心脏清洗后移除多余组织，然后转移至灌流系统灌注灌流缓冲液，然后灌注消化液直至心脏肿胀、颜色呈白色且表面松软，再延长灌流2～4min；
2)将左、右心房分别剪开，置于细胞收集液中消化处理，然后将心房剪碎、吹打，直至分离成单细胞，即无组织团块且分散均匀；
3)将步骤2)处理后的心房细胞离心、弃上清后用细胞保存液吹散重悬细胞，静置待活细胞自由沉降后，吸去上清，加入铺板培养基，吹打重悬细胞；
4)对步骤3)处理得到的细胞进行梯度复钙处理，然后在终浓度为1.0mM的钙离子的铺板培养基中存储，得到细胞混合液；
5)移除灌注系统，将得到的细胞混合液铺于玻璃片上，在37℃下孵育1～2h，添加铺板培养基培养1h后，更换至普通培养基中常规培养，每24h换液一次，完成培养。


2.根据权利要求1所述的成年小鼠心房肌细胞的分离与培养方法，其特征在于，步骤1)中，是以4mL/min的速度持续灌注4～7min的灌流缓冲液。


3.根据权利要求1所述的成年小鼠心房肌细胞的分离与培养方法，其特征在于，步骤2)中所述消化处理是在细胞收集液中于37℃水浴加热，持续消化15min。


4.根据权利要求1所述的成年小鼠心房肌细胞的分离与培养方法，其特征在于，步骤3)中，离心处理是以400-500rpm的条件处理5min。


5.根据权利要求1所述的成年小鼠心房肌细...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢文俊，戚瑛，李晶晶，张伊，徐睿，张玉，
申请(专利权)人：西安交通大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61