一种维生素D3及其类似物在促进癌细胞分化成脂肪细胞中的应用制造技术

本发明专利技术提供了维生素D3及其类似物在促进癌细胞分化成脂肪细胞中的应用，其是将癌细胞在进行体外诱导分化之前，用终浓度为10‑200nM的维生素D3或其类似物对细胞进行预处理，然后将癌细胞置于诱导分化培养基①，培养4‑8天；再将诱导分化培养基①换成诱导分化培养基②，培养1‑4天；然后换成基础培养基，培养6‑12天。这种“先维生素D3或其类似物预处理，再诱导分化”的模式能够高效率地将癌细胞成功诱导分化成脂肪细胞，显著提高癌细胞分化成脂肪细胞的效率。采用本方法可以高效地将癌细胞诱导分化成脂肪细胞，有效抑制癌细胞的增殖和转移，为临床上的癌症治疗提供新思路、新方法。

【技术实现步骤摘要】
一种维生素D3及其类似物在促进癌细胞分化成脂肪细胞中的应用
本专利技术涉及生物
，具体涉及维生素D3及其类似物在促进癌细胞分化成脂肪细胞中的应用。
技术介绍
在癌症病情发展过程中，存在一个叫做“上皮-间充质转化”(EMT，epithelial–mesenchymaltransitions)的阶段，该阶段内，癌细胞具有类似于“干细胞”的特质，有潜力转化成多种细胞类型。上皮细胞可向间质细胞形态转化，导致细胞极性丧失、黏附能力下降、细胞骨架发生变化，从而增强细胞迁移和运动的能力，利用EMT这些癌细胞会从初始的肿瘤中脱离，向远处发生转移。研究证实EMT是与癌症的侵袭和转移有牵连的关键事件。肿瘤细胞经过血液循环传播后，肿瘤细胞会发生间质上皮转化(MET，mesenchymal–epithelialtransitions)，形成继发性的肿瘤转移灶。MET是EMT的逆过程，癌细胞由间质细胞形态变回上皮细胞形态，增殖能力增强，生长更快。科学家在小鼠身上使用罗格列酮联合MEK抑制剂曲米替尼，让乳腺癌细胞分化成脂肪细胞，降低了肿瘤的侵袭性，抑制了肿瘤转移，其主要采用的方法是：将乳腺癌细胞接种到培养皿中，过夜培养后用200ng/ml的人源重组BMP2蛋白处理3天，然后用200ng/ml的BMP2和2uM的Rosiglitazone(罗格列酮)处理4天，然后再用2μM的罗格列酮处理3天。其采用的培养基为含有10％胎牛血清的DMEM培养基。结果显示，经过罗格列酮+骨形成蛋白-2(BMP-2)的诱导后，EMT后的乳腺癌细胞转化成了脂肪细胞，表达各种脂肪细胞标志物，对异丙肾上腺素和胰岛素的反应也跟脂肪细胞一样；并且在诱导分化9天后之后，研究人员撤去诱导分化培养基，换上普通培养基，观察发现这些分化成的脂肪细胞保持着脂肪细胞的特征，并没有出现恢复成间充质样的癌细胞的情况，证实这种诱导分化是不可逆的。但是这种癌细胞诱导分化方法存在明显的缺陷。该方法只能将EMT之后的癌细胞诱导分化成脂肪细胞，即只能将处于间充质状态的癌细胞诱导分化，而不能将处于上皮状态的癌细胞诱导分化。该方法中BMP2的使用就是为了促进癌细胞EMT转化。因此，该方法对癌细胞的诱导分化条件苛刻，具有很大局限性，不具有普遍性。专利技术人前期研究中，发现维生素D3及其类似物在促进人皮肤成纤维细胞分化为脂肪细胞中具有优异的促进转化的效果(参见中国专利CN111518752A)，但正常的人皮肤成纤维细胞与癌细胞在生长发育、生理机制等方面存在明显的不同，主要表现在：第一，人皮肤成纤维细胞传代次数有限，不具有无限增殖、转移的能力，不会经历EMT或者MET转化。而癌细胞属于无限增殖细胞，并具有恶性转移的能力，会经历EMT或者MET转化。第二，人皮肤成纤维细胞一般处于静息状态，通常会在创伤修复时大量增殖，并分泌胶原纤维和胞外基质，参与伤口愈合。而癌细胞时刻处于增殖或转移状态，几乎不分泌胶原纤维和胞外基质。第三，人皮肤成纤维细胞由胚胎时期的间充质细胞分化而来，一般存在于皮肤的结缔组织中，处于间充质状态。而癌细胞种类繁多，来源广泛，有的处于上皮状态，有的则处于间充质状态。因此，癌细胞的诱导分化较为复杂、困难。有待于研究更加简便、普适性强的有效方法用于癌细胞向脂肪细胞的诱导分化。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供维生素D3及其类似物在促进癌细胞分化成脂肪细胞中的应用。第一方面，本专利技术提供了维生素D3(1,25-DihydroxyvitaminD3，Calcitriol)及其类似物在促进癌细胞分化成脂肪细胞中的应用。本专利技术发现在诱导癌细胞分化为脂肪细胞之前，采用维生素D3及其类似物进行预处理可以有效提高癌细胞分化为脂肪细胞的效率。上述应用表现在癌细胞在进行体外诱导分化之前，用终浓度为10-200nM的维生素D3或其类似物对癌细胞进行预处理；所述维生素D3的类似物为钙泊三醇(Calcipotriol)。优选地，用终浓度为10-200nM的维生素D3或其类似物对癌细胞进行预处理。第二方面，本专利技术提供了一种体外诱导癌细胞分化成脂肪细胞的方法，包括以下步骤：(1)将癌细胞于基础培养基中进行培养，待细胞汇合度达50-70％时，加入终浓度为10-200nM的维生素D3或其类似物，对癌细胞预处理；(2)将步骤(1)的基础培养基换成诱导分化培养基①，培养4-8天；(3)将诱导分化培养基①换成诱导分化培养基②，培养1-4天；(4)换成基础培养基，培养6-12天；其中，所述基础培养基为含胎牛血清、抗生素的高糖DMEM培养基；所述诱导分化培养基①为含有地塞米松、胰岛素、罗格列酮和1-甲基-3-异丁基黄嘌呤的基础培养基；所述诱导分化培养基②为含胰岛素的基础培养基。上述方法的步骤(1)中，加入终浓度为80-100nM的维生素D3或钙泊三醇。优选100nM的维生素D3或钙泊三醇。步骤(1)中，对癌细胞预处理12-48小时，优选20-30小时。本专利技术方法中，所述基础培养基为含5％-20％胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的高糖DMEM培养基；所述诱导分化培养基①为0.5-1μM地塞米松，5-20μg/mL胰岛素，1-2μM罗格列酮，0.2-0.5mM1-甲基-3-异丁基黄嘌呤的基础培养基；所述诱导分化培养基②为含5-20μg/mL胰岛素的基础培养基。采用对应的诱导分化培养基和基础培养基培养时，每两天换液一次，或根据实际情况按照本领域内常规操作要求进行癌细胞培养基的换液。优选地，所述诱导分化培养基①为1μM地塞米松，10μg/mL胰岛素，2μM罗格列酮，0.5mM1-甲基-3-异丁基黄嘌呤的基础培养基；所述诱导分化培养基②为含10μg/mL胰岛素的基础培养基。本专利技术方法的诱导分化环境条件为35℃～37℃，5％CO2。整个癌细胞诱导分化过程主要包括预处理、诱导分化两部分。在癌细胞汇合度达到50-70％时，进行维生素D3或其类似物钙泊三醇预处理12-48小时。然后，按照“4+2+10”分化模式进行诱导分化，即分化培养基①诱导4天，分化培养基②诱导2天，基础培养基继续培养10天。这种“先维生素D3或其类似物预处理，再诱导分化”的模式，极大地提高了癌细胞分化成脂肪细胞的效率。本专利技术提供将癌细胞诱导分化为脂肪细胞的一个具体的操作步骤，该具体操作用于解释本专利技术，但不限制本专利技术：取出泡在75％酒精中的盖玻片，在酒精灯上灼烧灭菌，然后铺在35mm的培养皿中，每个培养皿铺4个盖玻片；往培养皿中加入4mL基础培养基，并用镊子将重叠的盖玻片铺开，以备后面细胞传代使用。待10cm培养皿里的癌细胞长满后，吸掉培养皿中的培养基，用磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗2次，每次2mL；然后吸掉PBS，加入1mL浓度为0.25％的胰酶，双手反复晃动培养皿，使胰酶均匀浸润培养皿底部；最后放在含有5％CO2的细胞培养箱中，37℃消化1-2min；取出消化的细胞，往本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.维生素D3及其类似物在促进癌细胞分化成脂肪细胞中的应用。/n

【技术特征摘要】
1.维生素D3及其类似物在促进癌细胞分化成脂肪细胞中的应用。


2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，癌细胞在进行体外诱导分化之前，用终浓度为10-200nM的维生素D3或其类似物对癌细胞进行预处理；所述维生素D3的类似物为钙泊三醇。


3.一种体外诱导癌细胞分化成脂肪细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将癌细胞于基础培养基中进行培养，待细胞汇合度达50-70％时，加入终浓度为10-200nM的维生素D3或其类似物，对癌细胞预处理；
(2)将步骤(1)的基础培养基换成诱导分化培养基①，培养4-8天；
(3)将诱导分化培养基①换成诱导分化培养基②，培养1-4天；
(4)换成基础培养基，培养6-12天；
其中，所述基础培养基为含胎牛血清、抗生素的高糖DMEM培养基；
所述诱导分化培养基①为含有地塞米松、胰岛素、罗格列酮和1-甲基-3-异丁基黄嘌呤的基础培养基；
所述诱导分化培养基②为含胰岛素的基础培养基。


4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，加入终浓度为80-100nM的维生素D3或钙泊三醇。


5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，对...

【专利技术属性】
技术研发人员：张传茂，王向阳，辛广伟，迟王菲，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：北京;11