一种抑制PCSK9基因表达的RNA抑制剂及其应用制造技术

本发明专利技术属于生物化学领域，具体涉及一种抑制肝细胞中前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶Kexin9(PCSK9)基因表达的RNA抑制剂及其应用，所述的RNA抑制剂由正义链和反义链通过碱基配对形成，正义链和反义链彼此之间至少85％碱基互补，且部分或全部核苷酸糖基2’位的‑OH被氟或甲氧基取代，末端至少有连续3个核苷酸之间的磷酸酯被硫代。本发明专利技术提供的RNA抑制剂的结构中还含有5’MVIP和3'MVIP，使所述RNA抑制剂具有特异性的肝靶向。通过体内外药效实验证明，这种RNA抑制剂直接作用在PCSK9mRNA，持续高效地抑制PCSK9基因表达，降低血浆中LDL‑C的水平，用于治疗或/和预防由PCSK9基因介导的，包括但不限于高脂血症、动脉粥样硬化或与PCSK9基因介导有关的其它疾病。

【技术实现步骤摘要】
一种抑制PCSK9基因表达的RNA抑制剂及其应用
本专利技术属于生物化学领域，具体涉及一种抑制肝细胞中前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶Kexin9(PCSK9)基因表达的RNA抑制剂及其应用，所述的RNA抑制剂由正义链和反义链通过碱基配对形成，正义链和反义链彼此之间至少85％碱基互补，且部分或全部核苷酸糖基2’位的-OH被氟或甲氧基取代，末端至少有连续3个核苷酸之间的磷酸酯被硫代。本专利技术提供的RNA抑制剂的结构中还含有使所述RNA抑制剂具有肝靶向特异性的结构5’MVIP和3'MVIP，其中5’MVIP偶联在所述RNA抑制剂正义链和/或反义链5’末端，3’MVIP偶联在所述RNA抑制剂反义链和/或正义链3’末端，5’MVIP和3’MVIP都包含有肝靶向特异性配体X、支链L、接头B和连接链D，5’MVIP还包含与所述RNA抑制剂正义链或反义链5’末端连接的转接点R1，3’MVIP还包含与所述RNA抑制剂正义链或反义链3’末端连接的转接点R2，所述肝靶向特异性配体X、支链L或接头B在5’MVIP与3’MVIP各自的内部或5’MVIP与3’MVIP之间可以相同，也可以不同。通过体内外药效实验证明，本专利技术提供的RNA抑制剂直接作用在PCSK9mRNA，持续高效地抑制PCSK9基因表达，降低血浆中LDL-C的水平，用于治疗或/和预防由PCSK9基因介导的，包括但不限于高脂血症、动脉粥样硬化或与PCSK9基因介导有关的其它疾病。。
技术介绍
RNAiRNAi(RNA干扰)于1998年，由安德鲁·法厄(AndrewZ.Fire)等在秀丽隐杆线虫中进行反义RNA抑制实验时发现，并将这一过程称为RNAi。这一发现被《Science》杂志评为2001年的十大科学进展之一，并名列2002年十大科学进展之首。自此以后，以RNAi为作用机理的siRNA作为潜在的基因治疗药物得到人们广泛的关注，2006年，安德鲁·法厄与克雷格·梅洛(CraigC.Mello)由于在RNAi机制研究中的贡献获得诺贝尔生理或医学奖。RNAi是在许多生物中，包括动物、植物和真菌，都可由双链RNA(dsRNA)触发的，在RNAi过程中，一种称为“Dicer”的核酸内切酶将长链dsRNA切割或“切丁”成21～25个核苷酸长的小片段。这些小片段，被称为小干扰RNA(siRNA)，其中的反义链(Guidestrand)被加载到Argonaute蛋白(AGO2)上。AGO2加载发生在RISC-loading复合物中，这是一个三元复合物，由Argonaute蛋白、Dicer和dsRNA结合蛋白(简称为TRBP)组成。在装载过程中，正义链(Passengerstrand)链被AGO2裂解并排出。然后，AGO2使用反义链与包含完全互补序列的mRNA结合，然后催化这些mRNA的切割，致使mRNA分裂丧失翻译模板的作用，进而阻止相关蛋白质的合成。切割后，被切割的mRNA被释放，加载着反义链的RISC-loading复合物被循环用于另一轮的切割。据统计，在人体内的疾病相关蛋白中，大约超过80％的蛋白质不能被目前常规的小分子药物以及生物大分子制剂所靶向，属于不可成药蛋白。旨在通过基因的表达、沉默等功能治疗疾病的基因治疗被业界认为是继化学小分子药物、生物大分子药物之后的第三代治疗药物，这种疗法在基因水平上实现对疾病的治疗，不受不可成药蛋白的制约。作为基因治疗中RNAi技术最主流的类型，RNAi技术是从mRNA的水平对疾病进行治疗，相比化学小分子药物及生物大分子药物在蛋白质水平的治疗具有更高的效率。利用RNAi技术，可以根据特定基因序列，设计出特异性高、抑制效果好的siRNA的正义链和反义链序列，通过固相合成这些单链序列，然后正义链与反义链在特定的退火缓冲液中按照碱基配对原则配对成siRNA，最后通过载体系统输送到体内相应靶点，降解目标mRNA，破坏目标mRNA作为翻译模板的功能，从而阻止相关蛋白的合成。siRNA的递送系统siRNA在血液和组织中不稳定，容易被核酸酶降解，为了提高siRNA的稳定性，可以通过对siRNA的正义链和反义链修饰，但这些化学修饰只提供有限的免受核酸酶降解的保护作用并且可能最终影响siRNA的活性。因此，还需要相应的传递系统来保障siRNA安全高效的穿过细胞膜。由于siRNA分子质量较大，且带有大量负电荷，而且具有高水溶解性，所以自身无法顺利穿越细胞膜到达细胞内。脂质体基本结构是由亲水核和磷脂双分子层构成，具备类似生物膜的磷脂双分子层，拥有很高的生物相容性，所以脂质体一度成为最受欢迎、应用最广泛的siRNA载体。脂质体介导的siRNA递送主要将siRNA包裹到脂质体内，保护siRNA不被核酸酶降解，提高siRNA的通过细胞膜障碍的效率，从而促进细胞的吸收。例如阴离子脂质体、pH敏感性脂质体、免疫脂质体、膜融合脂质体(fusogenicliposome)和阳离子脂质等等，尽管取得了一定的进展，但脂质体本身容易引发炎症反应，给药前必须使用多种抗组胺和激素类如西利替嗪和地塞米松类等药物，以减少可能发生的急性炎症反应，因此在实际临床应用中并不适合所有治疗领域，尤其像慢性乙肝这一类治疗周期长的疾病，长期使用可能产生的积蓄毒性是潜在的安全隐患，因此需要一种更安全有效的载体系统来递送siRNA。肝脏中去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)，是肝细胞特异性表达的受体，是一种高效的内吞型受体。由于体内生理情况下各种糖蛋白在酶或酸水解唾液酸后，暴露出的次末端是半乳糖残基，所以ASGPR特异性结合的糖为半乳糖基，故又称半乳糖特异性受体。半乳糖、半乳糖胺、N-乙酰半乳糖胺等单糖和多糖分子都对ASGPR有高亲和性。ASGPR主要生理功能是介导血液中去唾液酸糖蛋白、脂蛋白等物质的清除，且与病毒性肝炎、肝硬化、肝癌等肝脏疾病的发生发展有着密切联系。ASGPR这一特性的发现，对肝源性疾病的诊断及治疗起着重要作用(AshwellG、HarfordJ，CarbohydratespecificReceptorsoftheLiver，AnnRevBiochem198251:531-554)。结构中含有半乳糖或半乳糖胺及其衍生物的肝源性疾病治疗药物可以特异性地与ASGPR亲和，从而具有主动肝靶向性，不需要其它的载体系统来输送。前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶Kexin9(PCSK9)2003年，研究人员在法国的一个家系中发现了编码前白蛋白转化酶枯草菌素9(ProproteinConvertaseSubtilisin/Kexintype9，PCSK9)的基因突变可能与家族性高胆固醇血症(familialhypercholesterolemia,FH)相关。PCSK9是前蛋白转化酶家族中的第9个蛋白酶K亚家族，PCSK9是一种主要由肝细胞产生的蛋白酶。血浆中的PCSK9与肝细胞表面的低密度脂蛋白受体(lowdensitylipoproteinreceptor，LDLR)结合，PCSK9-LDLR结合体经内吞作用进入肝脏细胞内并在溶酶体上被降解，使肝细胞表面LDLR减少。LDLR的减少导致血浆中的LDL本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抑制PCSK9基因表达的RNA抑制剂或其药学上可接受的盐，其中，/n所述RNA抑制剂由链长为15-30的正义链和反义链通过碱基配对形成，其中链长优选为19-23。/n

【技术特征摘要】
1.一种抑制PCSK9基因表达的RNA抑制剂或其药学上可接受的盐，其中，
所述RNA抑制剂由链长为15-30的正义链和反义链通过碱基配对形成，其中链长优选为19-23。


2.根据权利要求1所述的RNA抑制剂或其药学上可接受的盐，其中，
所述正义链和反义链之间至少有85％的碱基互补；
所述正义链或反义链的部分或全部核苷酸糖基2’位的-OH可以被取代，其中，所述取代基团为氟或甲氧基，优选从所述正义链5’末端开始的第5、7、8、9位的核苷酸糖基2’位的-OH被氟代且从所述反义链的5'末端开始的第7、12、14位核苷酸糖基2’位的-OH被氟代，其余的核苷酸糖基2’位的-OH被甲氧基取代；
且所述正义链或反义链的末端至少有3个相邻核苷酸之间的磷酸酯键可以硫代。


3.根据权利要求2所述的RNA抑制剂或其药学上可接受的盐，其中，所述正义链为SEQIDNO.351或与其相差一个、两个或三个核苷酸的序列；所述反义链为SEQIDNO.366或与其相差一个、两个或三个核苷酸的序列：
正义链：5'ccaaagaugucaucaaugagg3'SEQIDNO.:351
反义链：5'ucauugaugacaucuuuggca3'SEQIDNO.:366
其中，g＝鸟苷酸，a＝腺苷酸，u＝尿苷酸，c＝胞苷酸。


4.根据权利要求3所述的RNA抑制剂或其药学上可接受的盐，其中，所述正义链为SEQIDNO.534或与其相差一个、两个或三个核苷酸的序列；所述反义链为SEQIDNO.435或与其相差一个、两个或三个核苷酸的序列：
正义链：5'CsCsAAfAGfAfUfGUCAUCAAUsGsA3'SEQIDNO.:534
反义链：5'UsCsAUUGfAUGACfAUfCUUUGGsCsA3'SEQIDNO.:435
其中，G＝2'-O-甲基鸟苷酸，A＝2'-O-甲基腺苷酸，U＝2'-O-甲基尿苷酸，C＝2'-O-甲基胞苷酸；Gs＝2'-O-甲基-3’-硫代鸟苷酸，As＝2'-O-甲基-3'-硫代腺苷酸，Us＝2'-O-甲基-3'-硫代尿苷酸，Cs＝2'-O-甲基-3'-硫代胞苷酸；fG＝2'-氟鸟苷酸，fA＝2'-氟腺苷酸，fU＝2'-氟尿苷酸，fC＝2'-氟胞苷酸；fGs＝2'-氟-3'-硫代鸟苷酸，fAs＝2'-氟-3'-硫代腺苷酸，fUs＝2'-氟-3'-硫代尿苷酸，fCs＝2'-氟-3'-硫代胞苷酸。


5.根据权利要求1-4中任一项所述的RNA抑制剂或其药学上可接受的盐，其中，所述RNA抑制剂还含有5’MVIP和3’MVIP的组合，其中，
所述5’MVIP和3’MVIP为带有肝靶向特异性配体X的配体结构，其还包含支链L、接头B和连接链D；
所述5’MVIP偶联在所述正义链和/或反义链5’末端，其还包含与所述正义链或反义链5’末端连接的转接点R1；
所述3’MVIP偶联在所述反义链和/或正义链3’末端，其包含与所述正义链或反义链3’末端连接的转接点R2；
所述5’MVIP的结构如通式I所示，所述3’MVIP的结构如通式II所示，



其中，
n和m分别为0-4的整数，优选为1-3的整数，且n+m＝2-6的整数，优选n+m＝2、3或4，更优选为4；
所述转接点R1和R2结构中带有-NH-、硫原子或氧原子，一般结构中至少有一个-NH-、硫原子或氧原子，R1和R2通过结构中-NH-、硫原子或氧原子分别与5'M...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔坤元，卢雪琴，
申请(专利权)人：厦门甘宝利生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：福建;35