一种冠状病毒刺突蛋白单克隆抗体的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种冠状病毒刺突蛋白单克隆抗体的制备方法，采用切向流超滤的方法对获取的刺突蛋白进行浓缩，并采用层析纯化的方法对浓缩后的所述刺突蛋白进行纯化；利用纯化的所述刺突蛋白受体结合域对小鼠进行免疫，并对免疫完成后的小鼠脾细胞悬液与骨髓瘤细胞进行融合，得到杂交瘤细胞；将所述刺突蛋白受体结合域包被至酶标板中，然后对所述杂交瘤细胞进行间接ELISA筛选，得到阳性克隆；对所述阳性克隆进行亚克隆，并采用无血清发酵培养筛选出的杂交瘤稳定细胞株，纯化后得到刺突蛋白单克隆抗体，能够提高对冠状病毒的治愈率。

【技术实现步骤摘要】
一种冠状病毒刺突蛋白单克隆抗体的制备方法
本专利技术涉及单克隆抗体制备
，尤其涉及一种冠状病毒刺突蛋白单克隆抗体的制备方法。
技术介绍
基于目前的流行病学调查，目前流形的病毒的潜伏期一般为3-7天，最长不超过14天。此次疫情临床表现以发热、乏力、干咳为主要表现。少数患者伴有鼻塞、流涕、腹泻等症状。部分患者仅表现为低热、轻微乏力等，无肺炎表现，多在1周后恢复。世界卫生组织将本次引起病毒性肺炎病例的病原体命名为2019新型冠状病毒，即为SARS-CoV-2病毒，刺突蛋白是SARS-CoV-2的表面膜蛋白，包含两个亚基，S1和S2，S1主要包含一个受体结合域，负责识别细胞表面受体，S2包含膜融合所需的基本元素。现阶段出现的SARS-CoV-2病毒感染能力极强，且未出现有效的药物，能够将SARSCoV-2病毒进行消除，使得患者仅能凭借自身抵抗力治愈，大大降低了SARS-CoV-2病毒的治愈率。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种冠状病毒刺突蛋白单克隆抗体的制备方法，提高对SARS-CoV-2病毒的治愈率。为实现上述目的，本专利技术提供了一种冠状病毒刺突蛋白单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：采用切向流超滤的方法对获取的刺突蛋白进行浓缩，并采用层析纯化的方法对浓缩后的所述刺突蛋白进行纯化；利用纯化的所述刺突蛋白受体结合域对小鼠进行免疫，并对免疫完成后的小鼠脾细胞悬液与骨髓瘤细胞进行融合，得到杂交瘤细胞；将所述刺突蛋白受体结合域包被至酶标板中，然后对所述杂交瘤细胞进行间接ELISA筛选，得到阳性克隆；对所述阳性克隆进行亚克隆，并采用无血清发酵培养筛选出的杂交瘤稳定细胞株，纯化后得到刺突蛋白单克隆抗体。刺突蛋白是SARS-CoV-2的表面膜蛋白，包含两个亚基S1和S2，S1主要包含一个受体结合域，负责识别细胞表面受体，S2包含膜融合所需的基本元素，S蛋白在诱导中与抗体和T细胞反应以及保护性免疫中起关键作用，因此刺突蛋白单克隆抗体能够很好的与刺突蛋白进行结合形成复合物，该复合物能够被消化或降解，进而使得SARS-CoV-2病毒失活，达到杀死SARS-CoV-2病毒的效果，提高对SARS-CoV-2病毒的治愈率。其中，采用切向流超滤的方法对获取的刺突蛋白进行浓缩，并采用层析纯化的方法对浓缩后的所述刺突蛋白进行纯化，包括：获取制备所需的刺突蛋白，并将所述刺突蛋白在真空泵压力为0.1MPa，回流压力为0.05MPa的环境下，反复被50kDa超滤膜截留收集于收样杯中，直至浓缩体积至20mL；采用琼脂糖凝胶过滤层析柱对浓缩后的所述刺突蛋白进行多次纯化，收集洗脱液。提高对获取的刺突蛋白的纯度，保证得到的抗体的质量和效率。其中，利用纯化的所述刺突蛋白受体结合域对小鼠进行免疫，并对免疫完成后的小鼠脾细胞悬液与骨髓瘤细胞进行融合，得到杂交瘤细胞，包括：利用纯化后的所述刺突蛋白受体结合域对小鼠进行多次免疫，同时，每次免疫时间间隔两周；将免疫完成设定时间长度后的小鼠脾细胞与获取的小鼠骨髓瘤细胞以体积比1:1的比例进行混合；采用细胞融合仪进行细胞融合，融合后细胞铺板至96孔细胞培养板中，添加HAT筛选试剂，培养5天后进行一次全换液，得到杂交瘤细胞。通过对小鼠的多次免疫，能够尽可能的保证得到更多的免疫后的脾细胞，提高得到的抗体的数量。其中，将免疫完成设定时间长度后的小鼠脾细胞与获取的小鼠骨髓瘤细胞以体积比1:1的比例进行混合之前，所述方法还包括：取多次免疫后1周的小鼠脾脏，将小鼠脾脏放入盛有5mLDMEM液的培养皿中，碾碎过滤，得到脾细胞悬液。碾碎的目的是方便与骨髓瘤细胞的融合，以及抗体的提取。其中，将所述刺突蛋白受体结合域包被至酶标板中，然后对所述杂交瘤细胞进行间接ELISA筛选，得到阳性克隆，包括：将所述刺突蛋白受体结合域包被至酶标板中，在温度为4℃的条件下，进行过夜培养后，用pH7.4的PBST洗涤三次，加封闭液37℃封闭2个小时后弃掉封闭液37℃烘干；将所述杂交瘤细胞的上清液每孔100μL加入所述酶标板中，在温度为36-37℃的条件下，进行温育60min后，将质量分数为0.5‰的羊抗小鼠IgG酶标二抗每孔100μL加入酶标板中；在温度为36-37℃的条件下，进行温育60min后，将TMB单组份显色液每孔100μL加入所述酶标板中，室温作用15-20min后，每孔加入50μL终止液，进行间接ELISA筛选，保留阳性克隆。提高了帅选的阳性率和特异性。其中，所述封闭液为5％脱脂奶、1％BSA、1％OVA、2％明胶中的一种或多种。本专利技术的一种冠状病毒刺突蛋白单克隆抗体的制备方法，采用切向流超滤的方法对获取的刺突蛋白进行浓缩，并采用层析纯化的方法对浓缩后的所述刺突蛋白进行纯化；利用纯化的所述刺突蛋白受体结合域对小鼠进行免疫，并对免疫完成后的小鼠脾细胞悬液与骨髓瘤细胞进行融合，得到杂交瘤细胞；将所述刺突蛋白受体结合域包被至酶标板中，然后对所述杂交瘤细胞进行间接ELISA筛选，得到阳性克隆；对所述阳性克隆进行亚克隆，并采用无血清发酵培养筛选出的杂交瘤稳定细胞株，纯化后得到刺突蛋白单克隆抗体，能够提高对SARS-CoV-2病毒的治愈率。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1是本专利技术提供的一种冠状病毒刺突蛋白单克隆抗体的制备方法的步骤示意图。图2是本专利技术提供的一种冠状病毒刺突蛋白单克隆抗体的制备方法的流程示意图。具体实施方式下面详细描述本专利技术的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本专利技术，而不能理解为对本专利技术的限制。在本专利技术的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。请参阅图1和图2，本专利技术提供一种冠状病毒刺突蛋白单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：S101、采用切向流超滤的方法对获取的刺突蛋白进行浓缩，并采用层析纯化的方法对浓缩后的所述刺突蛋白进行纯化。具体的，获取制备抗体所需的刺突蛋白，并将所述刺突蛋白在真空泵压力为0.1MPa，回流压力为0.05MPa的环境下，反复被50kDa超滤膜截留收集于收样杯中，直至浓缩体积至20mL；试验过程中的滤出废液取样-20℃冻存待检。使用GE公司的琼脂糖凝胶Sepharose4FastFlow(4FF)过滤层析柱纯化刺突蛋白，琼脂糖凝胶过滤柱柱长约150cm，直径约2cm，上样体积不超过柱面积的10％，在使用前用PBS缓冲液平衡整个柱子，流速设定在0.3mL/本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种冠状病毒刺突蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：/n采用切向流超滤的方法对获取的刺突蛋白进行浓缩，并采用层析纯化的方法对浓缩后的所述刺突蛋白进行纯化；/n利用纯化的所述刺突蛋白受体结合域对小鼠进行免疫，并对免疫完成后的小鼠脾细胞悬液与骨髓瘤细胞进行融合，得到杂交瘤细胞；/n将所述刺突蛋白受体结合域包被至酶标板中，然后对所述杂交瘤细胞进行间接ELISA筛选，得到阳性克隆；/n对所述阳性克隆进行亚克隆，并采用无血清发酵培养筛选出的杂交瘤稳定细胞株，纯化后得到刺突蛋白单克隆抗体。/n

【技术特征摘要】
1.一种冠状病毒刺突蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
采用切向流超滤的方法对获取的刺突蛋白进行浓缩，并采用层析纯化的方法对浓缩后的所述刺突蛋白进行纯化；
利用纯化的所述刺突蛋白受体结合域对小鼠进行免疫，并对免疫完成后的小鼠脾细胞悬液与骨髓瘤细胞进行融合，得到杂交瘤细胞；
将所述刺突蛋白受体结合域包被至酶标板中，然后对所述杂交瘤细胞进行间接ELISA筛选，得到阳性克隆；
对所述阳性克隆进行亚克隆，并采用无血清发酵培养筛选出的杂交瘤稳定细胞株，纯化后得到刺突蛋白单克隆抗体。


2.如权利要求1所述的冠状病毒刺突蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，采用切向流超滤的方法对获取的刺突蛋白进行浓缩，并采用层析纯化的方法对浓缩后的所述刺突蛋白进行纯化，包括：
获取制备所需的刺突蛋白，并将所述刺突蛋白在真空泵压力为0.1MPa，回流压力为0.05MPa的环境下，反复被50kDa超滤膜截留收集于收样杯中，直至浓缩体积至20mL；
采用琼脂糖凝胶过滤层析柱对浓缩后的所述刺突蛋白进行多次纯化，收集洗脱液。


3.如权利要求1所述的冠状病毒刺突蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，利用纯化的所述刺突蛋白受体结合域对小鼠进行免疫，并对免疫完成后的小鼠脾细胞悬液与骨髓瘤细胞进行融合，得到杂交瘤细胞，包括：
利用纯化后的所述刺突蛋白受体结合域对小鼠进行多次免疫，同时，每次免疫时间间隔两周；
将免疫完成设定时间长度后的小鼠脾细胞与获取的小鼠骨髓瘤细胞以体积比1:1的比例进行混合；...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡云龙，
申请(专利权)人：南京川博生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32