一种高亲和力抗狂犬病病毒的全人源单克隆抗体及其用途制造技术

本发明专利技术涉及一种高亲和力抗狂犬病病毒的全人源单克隆抗体，属于生物免疫学领域。所述的单克隆抗体或其结合片段的重链可变区具有具有如SEQ IDNO:11、13、15、17和19任一项所示的重链可变区的核苷酸序列；和如SEQ IDNO:12、14、16、18和20任一项所示的轻链可变区的核苷酸序列。本发明专利技术还提供该抗体的编码基因、表达载体、用途和组合物。狂犬病毒糖蛋白(Glycoprotein，GP)是该病毒表面唯一的保护性抗原蛋白。本发明专利技术成功构建了狂犬病毒特异性抗原蛋白的原核表达载体，并利用大肠杆菌原核系统对其进行了表达和纯化，该抗原蛋白已成功用于抗体的筛选。并且已利用我们的筛选平台成功地筛选到了5株针对狂犬病毒GP片段的特异性全人源单克隆抗体序列，为临床上开发治疗狂犬病的抗体药物奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】
一种高亲和力抗狂犬病病毒的全人源单克隆抗体及其用途
本专利技术涉及生物免疫学领域，具体地说，涉及一种高亲和力抗狂犬病病毒的全人源单克隆抗体及其用途。
技术介绍
狂犬病(rabies)主要是由狂犬病毒(Rabiesvirus，RABV)引起的严重侵害中枢神经系统的急性传染病，在我国传染病分类中为乙类传染病。世界上最早关于狂犬病的资料记载始于4300年前的美索不达米亚，我国关于狂犬病的文字记载最早出现在距今约2500年的《左传》中。许多研究认为狂犬病起源于亚洲或欧洲，18世纪或由欧洲传入西半球，19世首次在南美洲发现。目前，狂犬病存在于除南极洲外的其他各个大洲，覆盖100多个国家。该病毒主要通过破损的皮肤、黏膜或呼吸道感染机体，唾液是其主要传染途径之一。几乎所有的哺乳类温热动物，如浣熊、臭鼬、蝙蝠、狐狸都是RABV宿主，主要传染源是患病或携带病毒的犬类[7]。大多数人类狂犬病主要是被患病动物咬伤所导致，部分患者是被抓挠或伤口、黏膜等污染所引起，鲜有因移植该病患者捐赠的器官或组织而发病的案例。RABV主要作用于中枢神经系统，大量存在于易感动物的脑脊液。人狂犬病主要表现为急性进展性脑脊髓炎，发病时通常有两种形式：以间接性的兴奋及幻觉伴随的狂躁型狂犬病，同时伴有恐风、恐水、恐声等症状，患者通常在7天内死亡，此外还有以肌无力为特征的麻痹型狂犬病，通常14天内导致死亡。该病潜伏期一般为3周至3个月，10天以内或长达1年及以上的报道极为少见[9]。据世界卫生组织(Worldhealthorganization，WHO)统计报道，全球每年有6万多人因狂犬病死亡，其中绝大多数发生在亚非洲地区，平均每10min有1人死亡，其中50％发生于15岁以下的孩童。此外，每年约有2千万只狗被无辜捕杀，其中因狂犬病被捕杀的达38只/min。中国狂犬病死亡率位于亚洲第二，仅次于印度，死亡人数高居我国传染病死亡数的前三位。中国每年用于狂犬病防疫的资金超过100亿元，而实际效果却差强人意。全球每年有1500多万人接受狂犬病暴露后预防接种，造成经济损失高达40亿美元。从1992年首个抗体药物Orthoclone上市以来，到2016年底共上市了63个抗体药物，平均每年上市2.5个抗体药物，且速度越来越快。抗体药物用于病毒感染性疾病的治疗早有报道，抗血清用于治疗SARS和重症H5N1丙型肝炎病毒感染者的案例已经证明了抗体在治疗病毒感染中发挥的重要作用。当前国内外狂犬单抗市场空缺较大，国内华北制药研发的重组人源狂犬抗体NM57s/NC08注射液于2018年已进入III期临床试验阶段，并于2020年4月取得III期临床试验报告，该单抗是由两种单抗NM57S、NC08联合所得的组合制剂，需与疫苗联合使用。国外市场方面，Zyduscadila研发的单抗RabiMabs于2019年5月被美国食品药品监督管理局(FoodandDrugAdministration，FDA)授予预防狂犬病的孤儿药资格，并于同年9月3日获得印度药品管理总局(DrugsControllerGeneralofIndia，DCGI)批准，可与疫苗联合用于狂犬病暴露后预防。印度血清研究所和MassBiologics共同研发的重组抗RABV单抗注射液Rabishield已于2016年12月在印度批准上市。全球市场上尚无用于防治狂犬病的全人源单抗，该类产品一旦上市并规模化生产，将极大地降低狂犬病的防治成本，具有传统血液制品和疫苗不可比拟的竞争优势。所以，我们希望通过本实验室特有的人记忆性B细胞体外活化后特异筛选法筛选到一株甚至多株广谱的具有治疗作用的抗狂犬病全人源单克隆抗体，改善狂犬病防治困难的现状。
技术实现思路
本专利技术人经过深入的研究，获得一种具有广谱结合狂犬病病毒的全人源单克隆抗体，本专利技术的单克隆抗体是全人源的，其重链、轻链可变区以及恒定区均来源于人的基因，因此具有免疫原性低、安全性高的特点。1861年狂犬病病毒基因首次被报道，其是单股不分节的负链RNA病毒，其外形类似子弹状，直径约为75nm，长度为100～300nm，约为12kb。病毒RNA编码5个蛋白，依次是核衣壳蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、糖蛋白(G)、聚合酶大蛋白(L)。本专利技术选用G蛋白作为抗原表位，G蛋白由1575个核苷酸组成，是唯一位于病毒表面的蛋白，能与细胞内受体乙酰胆碱受体结合使病毒具有嗜神经性，也能诱导宿主产生中和抗体，具有保护作用。本专利技术的一个方面在于提供一种抗狂犬病病毒的全人源单克隆抗体，其具有重链可变区和轻链可变区：(I)所述重链可变区的氨基酸序列具有SEQIDNO:11、13、15、17和19任一项所示的重链可变区的核苷酸序列；或具有SEQIDNO:11、13、15、17和19任一项所示氨基酸序列经替换、缺失或增加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列；(II)所述轻链可变区的氨基酸序列具有如SEQIDNO:12、14、16、18和20任一项所示的轻链可变区的核苷酸序列；或具有SEQIDNO:12、14、16、18和20任一项所示氨基酸序列经替换、缺失或增加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。优选地，该单克隆抗体具有如下任一组重链可变区和轻链可变区：(i)重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:11所示(1H10)；轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:12所示(3λ5)；(ii)重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:13所示(1H16)；轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:14所示(3λ7)；(iii)重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:15所示(1H17)；轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:16所示(3λ8)；(iv)重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:17所示(1H3)；轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:18所示(3λ1)；(v)重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:19所示(1H18)；轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:20所示(3λ10)。本专利技术提供的上述的单克隆抗体，能够特异性结合狂犬病病毒G蛋白。在本专利技术的另一方面，本专利技术还提供一种编码上述单克隆抗体的核酸分子。优选地，该核酸分子具有如SEQIDNO:1、3、5、7和9任一项所示的重链可变区的核苷酸序列；和如SEQIDNO:2、4、6、8和10任一项所示的轻链可变区的核苷酸序列。更优选地，该核酸分子具有如下任一组重链可变区和轻链可变区：(i)重链可变区的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示(1H10)；轻链可变区的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示(3λ5)；(ii)重链可变区的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示(1H16)；轻链可变区的核苷酸序列如SEQIDNO:4所示(3λ7)；(iii)重链可变区的核苷酸序列如SEQIDNO:5所示(1H17)；轻链可变区的核苷酸序列如SEQIDNO:6所示(3λ8)；(iv)重链可变区的核苷酸序列如SEQIDNO本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高亲和力抗狂犬病病毒的全人源单克隆抗体，其特征在于，其具有重链可变区和轻链可变区：/n(I)所述重链可变区的氨基酸序列具有SEQ ID NO:11、13、15、17和19任一项所示的重链可变区的核苷酸序列；或具有SEQ ID NO:11、13、15、17和19任一项所示氨基酸序列经替换、缺失或增加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列；/n(II)所述轻链可变区的氨基酸序列具有如SEQ ID NO:12、14、16、18和20任一项所示的轻链可变区的核苷酸序列；或具有SEQ ID NO:12、14、16、18和20任一项所示氨基酸序列经替换、缺失或增加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种高亲和力抗狂犬病病毒的全人源单克隆抗体，其特征在于，其具有重链可变区和轻链可变区：
(I)所述重链可变区的氨基酸序列具有SEQIDNO:11、13、15、17和19任一项所示的重链可变区的核苷酸序列；或具有SEQIDNO:11、13、15、17和19任一项所示氨基酸序列经替换、缺失或增加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列；
(II)所述轻链可变区的氨基酸序列具有如SEQIDNO:12、14、16、18和20任一项所示的轻链可变区的核苷酸序列；或具有SEQIDNO:12、14、16、18和20任一项所示氨基酸序列经替换、缺失或增加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。


2.根据权利要求1所述单克隆抗体，其特征在于，其具有如下任一组重链可变区和轻链可变区：
(i)重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:11所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:12所示；
(ii)重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:13所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:14所示；
(iii)重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:15所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:16所示；
(iv)重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:17所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:18所示；
(v)重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:19所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:20所示。


3.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述抗体特异性结合狂犬病病毒G蛋白。


4.编码如权利要求1-3任一项所述单克隆抗体的核酸分子，其特征在于，具有如SEQIDNO:1、3、5、7和9任一项所示的重链可变区的核苷酸序列；和如SEQIDNO:2、4、6、8和10任一项所示的轻链可变区的核苷酸序列。


5.根据权利要求4所述的核酸分子，其特征在于，其具有如下任一组重链可变区...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡萍，辛洪波，王纯艳，刘苏俊，张文华，
申请(专利权)人：南昌大学，
类型：发明
国别省市：江西;36