特异性结合新型冠状病毒的抗体制造技术

补体激活是新型冠状病毒‑19(COVID‑19)患者发病率和死亡率的危险因素，在补体激活的凝集素途径中，由严重急性呼吸窘迫综合征相关冠状病毒2(SARS‑CoV‑2)与丝氨酸蛋白酶MASP‑2结合的高免疫致病性核衣壳蛋白(N)介导。本发明专利技术从一个快速恢复的COVID‑19康复者身上分离并鉴定获得具有抗SARS‑CoV‑2病毒N蛋白的显性抗体，该抗体具有高结合亲和力。此外，基于补体蛋白酶MASP‑2对特异性荧光猝灭肽底物的裂解活性，本发明专利技术还开发了一种无病毒补体超激活分析方法。

【技术实现步骤摘要】
特异性结合新型冠状病毒的抗体
技术介绍
SARS-CoV-2、SARS-CoV、Zika、MERS-CoV、Ebola、H7N9等RNA病毒在局部地区/世界范围内的大规模爆发流行，给人们的生命健康带来严重危害的同时，也对国家及世界的经济发展带来巨大的冲击。冠状病毒(SARS-CoV)是被包膜的病毒(所被包膜衍生自宿主细胞膜的脂质双层)，具有主要由病毒结构蛋白(例如刺突蛋白(Spike，S)，膜蛋白(Membrane，M)，包膜蛋白(Envelope，E)和核衣壳蛋白(Nucleocapsid，N))形成的病毒结构，其中S蛋白、M蛋白和E蛋白均嵌入在病毒包膜中，N蛋白与病毒RNA结合，将基因组包装在核糖核蛋白颗粒中。与具有一定突变频率的刺突蛋白(S)不同，核衣壳蛋白的序列更稳定，这意味着它是诊断工具和抗病毒治疗的理想靶标。补体是先天性免疫的第一道防线之一，对细胞完整性、组织稳态和调节适应性免疫应答至关重要。新的证据表明，补体系统在COVID-19危重患者中起着至关重要的作用，所述危重患者特征是非典型急性呼吸窘迫综合征、弥漫性血管内凝血和多器官衰竭。一些证据表明，高致病性冠状病毒(SARS-CoV-2和SARS-CoV)N蛋白参与了MASP-2依赖性补体激活的启动。令人鼓舞的是，COVID-19危重患者接受补体抑制剂治疗，包括补体成分C3的小分子和补体成分C5的靶向抗体，显示出显著的治疗效果。目前，针对补体途径有11个临床试验，均为靶向人源自身蛋白，尚无靶向病毒蛋白的补体抑制剂。为了避免人类补体成分靶向治疗的不良反应，病毒蛋白靶向治疗是非常有必要的。SARS-CoV-2病毒N蛋白是一种高免疫致病性病毒蛋白，在体液免疫应答中产生高滴度的结合抗体。然而，对于这些结合抗体的潜在治疗应用知之甚少。本专利技术披露的抗体来源于COVID-19康复期患者，其特异性靶向SARS-CoV-2病毒N蛋白并改善功能受损的补体超激活，适用于新型冠状病毒感染的医学治疗、预防和/或诊断中，还可用于治疗各种与新型冠状病毒感染相关的疾病。进一步地，本专利技术还开发了一种临床自身免疫性疾病血清蛋白酶酶法来评估SARS-CoV-2病毒N蛋白存在时补体激活水平。
技术实现思路
本专利技术因此提供了一种新的结合SARS-CoV-2病毒的抗体及其抗原结合片段；以及其编码核酸序列；包含其的载体、宿主细胞；本专利技术还提供了一种治疗和/或诊断COVID-19患者的方法；此外，本专利技术提供了SARS-CoV-2病毒N蛋白的新抗原表位。第一方面，本专利技术提供了SARS-CoV-2病毒N蛋白上的新抗原表位，其包含N蛋白的第159-172位氨基酸残基，例如第L159，Q160，L161，P162，Q163，G164，T165，T166，L167，P168，K169，G170，F171和Y172位的氨基酸残基。在一个优选实施方案中，本专利技术提供的新抗原表位包含SARS-CoV-2病毒N蛋白的第Q163，L167和K169位氨基酸残基。第二方面，本专利技术提供了特异性强的以高效价结合新型冠状病毒的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，本专利技术的抗体与新型冠状病毒的核衣壳蛋白(N蛋白)结合。在一个实施方案中，本文中提供的是特异性结合SARS-CoV-2病毒N蛋白的抗体，其中该抗体包含下面的六种互补性决定区(CDR)：包含SEQIDNO：1的氨基酸序列的VHCDR1；包含SEQIDNO：2的氨基酸序列的VHCDR2；包含SEQIDNO：3的氨基酸序列的VHCDR3；包含SEQIDNO：4的氨基酸序列的VLCDR1；包含SEQIDNO：5的氨基酸序列的VLCDR2；和包含SEQIDNO：6的氨基酸序列的VLCDR3。在一些实施方案中，该抗体进一步包含如SEQIDNO：7所示氨基酸序列的重链可变区，或与SEQIDNO：7的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的重链可变区。在一些实施方案中，本专利技术提供的抗体包含如SEQIDNO：8所示氨基酸序列的轻链可变区，或与SEQIDNO：8的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的轻链可变区序列。在另一些实施方案中，本专利技术提供的抗体包含上述的重链可变区序列和轻链可变区序列。在另一个实施方案中，本文中提供的是特异性结合SARS-CoV-2病毒N蛋白的抗体，其中该抗体包含下面的六种互补性决定区(CDR)：包含SEQIDNO：11的氨基酸序列的VHCDR1；包含SEQIDNO：12的氨基酸序列的VHCDR2；包含SEQIDNO：13的氨基酸序列的VHCDR3；包含SEQIDNO：14的氨基酸序列的VLCDR1；包含SEQIDNO：15的氨基酸序列的VLCDR2；和包含SEQIDNO：16的氨基酸序列的VLCDR3。在一些实施方案中，该抗体进一步包含如SEQIDNO：17所示氨基酸序列的重链可变区，或与SEQIDNO：17的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的重链可变区。在一些实施方案中，本专利技术提供的抗体包含如SEQIDNO：18所示的氨基酸序列的轻链可变区，或与SEQIDNO：18的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。在另一些实施方案中，本专利技术提供的抗体包含上述的重链可变区序列和轻链可变区序列。在另一个实施方案中，本文中提供的是特异性结合SARS-CoV-2病毒N蛋白的抗体，其中该抗体包含下面的六种互补性决定区(CDR)：包含SEQIDNO：21的氨基酸序列的VHCDR1；包含SEQIDNO：22的氨基酸序列的VHCDR2；包含SEQIDNO：23的氨基酸序列的VHCDR3；包含SEQIDNO：24的氨基酸序列的VLCDR1；包含SEQIDNO：25的氨基酸序列的VLCDR2；和包含SEQIDNO：26的氨基酸序列的VLCDR3。在一些实施方案中，该抗体包含如SEQIDNO：27所示的氨基酸序列的重链可变区，或与SEQIDNO：27的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的重链可变区序列。在一些实施方案中，本专利技术提供的抗体包含的轻链可变区如SEQIDNO：28所示的氨基酸序列，或与SEQIDNO：28的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。在另一些实施方案中，本专利技术提供的抗体包含上述的重链可变区序列和轻链可变区序列。在另一个实施方案中，本文中提供的是特异性结合SARS-CoV-2病毒N蛋白的抗体，其中该抗体包含下面的六种互补性决定区(CDR)：包含SEQIDNO：31的氨基酸序列的VHCDR1；包含SEQIDNO：32的氨基酸序列的VHCDR2；包含SEQIDNO：33的氨基酸序列的VHCDR3；包含SEQIDNO：34的氨基酸序列的VL本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种特异性地结合SARS-CoV-2病毒N蛋白的人抗体或其抗原结合片段，其包含：/n1)如SEQ ID NO:7所示的重链可变区的3个互补决定区CDR，以及如SEQ ID NO:8所示的轻链可变区的3个互补决定区CDR；/n2)如SEQ ID NO:17所示的重链可变区的3个互补决定区CDR，以及如SEQ ID NO:18所示的轻链可变区的3个互补决定区CDR；/n3)如SEQ ID NO:27所示的重链可变区的3个互补决定区CDR，以及如SEQ ID NO:28所示的轻链可变区的3个互补决定区CDR；/n4)如SEQ ID NO:37所示的重链可变区的3个互补决定区CDR，以及如SEQ ID NO:38所示的轻链可变区的3个互补决定区CDR；/n5)如SEQ ID NO:47所示的重链可变区的3个互补决定区CDR，以及如SEQ ID NO:48所示的轻链可变区的3个互补决定区CDR；/n6)如SEQ ID NO:57所示的重链可变区的3个互补决定区CDR，以及如SEQ ID NO:58所示的轻链可变区的3个互补决定区CDR；/n7)如SEQ ID NO:67所示的重链可变区的3个互补决定区CDR，以及如SEQ ID NO:68所示的轻链可变区的3个互补决定区CDR；/n8)如SEQ ID NO:77所示的重链可变区的3个互补决定区CDR，以及如SEQ ID NO:78所示的轻链可变区的3个互补决定区CDR；或/n9)如SEQ ID NO:87所示的重链可变区的3个互补决定区CDR，以及如SEQ ID NO:88所示的轻链可变区的3个互补决定区CDR。/n...

【技术特征摘要】
1.一种特异性地结合SARS-CoV-2病毒N蛋白的人抗体或其抗原结合片段，其包含：
1)如SEQIDNO:7所示的重链可变区的3个互补决定区CDR，以及如SEQIDNO:8所示的轻链可变区的3个互补决定区CDR；
2)如SEQIDNO:17所示的重链可变区的3个互补决定区CDR，以及如SEQIDNO:18所示的轻链可变区的3个互补决定区CDR；
3)如SEQIDNO:27所示的重链可变区的3个互补决定区CDR，以及如SEQIDNO:28所示的轻链可变区的3个互补决定区CDR；
4)如SEQIDNO:37所示的重链可变区的3个互补决定区CDR，以及如SEQIDNO:38所示的轻链可变区的3个互补决定区CDR；
5)如SEQIDNO:47所示的重链可变区的3个互补决定区CDR，以及如SEQIDNO:48所示的轻链可变区的3个互补决定区CDR；
6)如SEQIDNO:57所示的重链可变区的3个互补决定区CDR，以及如SEQIDNO:58所示的轻链可变区的3个互补决定区CDR；
7)如SEQIDNO:67所示的重链可变区的3个互补决定区CDR，以及如SEQIDNO:68所示的轻链可变区的3个互补决定区CDR；
8)如SEQIDNO:77所示的重链可变区的3个互补决定区CDR，以及如SEQIDNO:78所示的轻链可变区的3个互补决定区CDR；或
9)如SEQIDNO:87所示的重链可变区的3个互补决定区CDR，以及如SEQIDNO:88所示的轻链可变区的3个互补决定区CDR。


2.一种特异性结合SARS-CoV-2病毒N蛋白的人抗体或其抗原结合片段，其中该抗体包含下面的互补性决定区(CDR)：
1)包含SEQIDNO：1的氨基酸序列的VHCDR1；
包含SEQIDNO：2的氨基酸序列的VHCDR2；
包含SEQIDNO：3的氨基酸序列的VHCDR3；
包含SEQIDNO：4的氨基酸序列的VLCDR1；
包含SEQIDNO：5的氨基酸序列的VLCDR2；和
包含SEQIDNO：6的氨基酸序列的VLCDR3；或
2)包含SEQIDNO：11的氨基酸序列的VHCDR1；
包含SEQIDNO：12的氨基酸序列的VHCDR2；
包含SEQIDNO：13的氨基酸序列的VHCDR3；
包含SEQIDNO：14的氨基酸序列的VLCDR1；
包含SEQIDNO：15的氨基酸序列的VLCDR2；和
包含SEQIDNO：16的氨基酸序列的VLCDR3；或
3)包含SEQIDNO：21的氨基酸序列的VHCDR1；
包含SEQIDNO：22的氨基酸序列的VHCDR2；
包含SEQIDNO：23的氨基酸序列的VHCDR3；
包含SEQIDNO：24的氨基酸序列的VLCDR1；
包含SEQIDNO：25的氨基酸序列的VLCDR2；和
包含SEQIDNO：26的氨基酸序列的VLCDR3；或
4)包含SEQIDNO：31的氨基酸序列的VHCDR1；
包含SEQIDNO：32的氨基酸序列的VHCDR2；
包含SEQIDNO：33的氨基酸序列的VHCDR3；
包含SEQIDNO：34的氨基酸序列的VLCDR1；
包含SEQIDNO：35的氨基酸序列的VLCDR2；和
包含SEQIDNO：36的氨基酸序列的VLCDR3；或
5)包含SEQIDNO：41的氨基酸序列的VHCDR1；
包含SEQIDNO：42的氨基酸序列的VHCDR2；
包含SEQIDNO：43的氨基酸序列的VHCDR3；
包含SEQIDNO：44的氨基酸序列的VLCDR1；
包含SEQIDNO：45的氨基酸序列的VLCDR2；和
包含SEQIDNO：46的氨基酸序列的VLCDR3；或
6)包含SEQIDNO：51的氨基酸序列的VHCDR1；
包含SEQIDNO：52的氨基酸序列的VHCDR2；
包含SEQIDNO：53的氨基酸序列的VHCDR3；
包含SEQIDNO：54的氨基酸序列的VLCDR1；
包含SEQIDNO：55的氨基酸序列的VLCDR2；和
包含SEQIDNO：56的氨基酸序列的VLCDR3；或
7)包含SEQIDNO：61的氨基酸序列的VHCDR1；
包含SEQIDNO：62的氨基酸序列的VHCDR2；
包含SEQIDNO：63的氨基酸序列的VHCDR3；
包含SEQIDNO：64的氨基酸序列的VLCDR1；
包含SEQIDNO：65的氨基酸序列的VLCDR2；和
包含SEQIDNO：66的氨基酸序列的VLCDR3；或
8)包含SEQIDNO：71的氨基酸序列的VHCDR1；
包含SEQIDNO：72的氨基酸序列的VHCDR2；
包含SEQIDNO：73的氨基酸序列的VHCDR3；
包含SEQIDNO：74的氨基酸序列的VLCDR1；
包含SEQIDNO：75的氨基酸序列的VLCDR2；和
包含SEQIDNO：76的氨基酸序列的VLCDR3；或
9)包含SEQIDNO：81的氨基酸序列的VHCDR1；
包含SEQIDNO：82的氨基酸序列的VHCDR2；
包含SEQIDNO：83的氨基酸序列的VHCDR3；
包含SEQIDNO：84的氨基酸序列的VLCDR1；
包含SEQIDNO：85的氨基酸序列的VLCDR2；和
包含SEQIDNO：86的氨基酸序列的VLCDR3。


3.权利要求1或2所述的人抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区VH和/或轻链可变区VL，其中，
(a)重链可变区VH
(i)包含与SEQIDNO:7、17、27、37、47、57、67、77、87中任一项所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94...

【专利技术属性】
技术研发人员：单鸿，陈守登，廖化新，郑伟宏，肖非，康斯斯，
申请(专利权)人：中山大学附属第五医院，珠海泰诺麦博生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44